[发明专利]用于非酶切非色谱纯化方法原核表达融合蛋白Prx的类弹性蛋白多肽ELP

说明书

技术领域

本发明涉及一种类弹性蛋白多肽ELP，尤其涉及一种用于非酶切非色谱纯化方法原核表达融合蛋白Prx的类弹性蛋白多肽ELP，属基因工程领域。

背景技术

非酶切非色谱纯化技术是一种用基因工程的方法分离纯化融合蛋白的方法。传统的蛋白纯化依赖于色谱纯化，该方法所用仪器价格昂贵，使蛋白生产成本高；含有融合蛋白的目的蛋白在纯化后需要工具酶(如肠激酶)切除标签，该酶生产成本高，特异性差。内含肽介导的自切使得无需加入工具酶，蛋白在一定条件下诱导即可从前体蛋白上游离出来；利用类弹性蛋白的弹性功能进行非色谱纯化蛋白，无需使用色谱柱分离，一定温度下孵育，目的蛋白就会沉淀，而且沉淀还可以重新溶解于冰冷的缓冲溶液中，这使蛋白纯化更加高效快捷、经济、操作简单。因此，类弹性蛋白多肽及内含肽的筛选对非酶切非色谱纯化技术尤为重要。

类弹性蛋白多肽ELP是一种人造基因工程蛋白质聚合物，它不仅具有弹性功能，还对环境温度非常敏感。它的这些特殊性质使其在蛋白纯化与质粒DNA分离中应用广泛。其分子量大小从4-60kDa不等。早在10多年前，人们就开始将ELP标签应用于蛋白的非色谱纯化，30℃、一定盐浓度条件下，ELP会发生聚集，形成不溶的沉淀，将该沉淀通过离心的方法分离出来。[Wu WY et al,Recombinant protein purification by self-cleaving aggregation tag.Nat Protoc 2006；1:2257-2262]。环境温度、蛋白浓度、盐的种类、或者是ELP的长度会影响ELP这种多肽的沉淀。[Fong BA et al,Optimization of ELP-intein mediated protein purification by salt substitution.Protein Expr Purif 2009；66:198-202]。

内含肽inteins，是internal protein的缩写，最初是在1990年由Hirata等人发现的，因其特点与内含子很像，故称其内含肽。[Hirata R et al,Molecular structure of a gene,VMA1,encoding the catalytic subunit of H(+)-translocating adenosine triphosphatase from vacuolar membranes of Saccharomyces cerevisiae.J Biol Chem.1990；265:6726-C6733]。大量的基因组测序结果表明内含肽不仅存在于噬菌体和病毒中，还广泛存在于古生菌、细菌和真核生物中。2009年末，inBase共收集了多达450种内含肽。[Perler FB InBase:the Intein Database.Nucl Acids Res.2002；30:383-384]。内含肽大致分两类，大内含肽和小内含肽，它们的区别在于大内含肽中含有归为内切酶结构域，而小内含肽没有。自切效率较高的mini内含肽是将大内含肽中的内切酶结构域去除后得到的，该区域对于蛋白的裂解没有影响。[Chong S et al,Protein splicing of the Saccharomyces cerevisiae VMA intein without the endonuclease motifs.J Biol Chem.1997；272:15587-155890；Derbyshire Vt et al,Genetic definition of a protein-splicing domain:functional mini-inteins support structure predictions and a model for intein evolution.Proc Natl Acad Sci USA 1997；94:11466-11471]。通常，细胞内首先形成一个前体蛋白，在其成熟过程中，内含肽会通过裂解反应从其C端断开，然后从其N端断开，C端和N端的部分又称为外显肽，这两部分会通过分子内反应形成共价键。[Perler FB et al,Protein splicing elements:inteins and exteins-a definition of terms and recommended nomenclature.Nucl Acids Res.1994；22:1125-1127]。