[发明专利]一种短小芽孢杆菌菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于益生菌筛选技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)在细菌分类上隶属于厚壁菌门(Firmicutes)(低G+C革兰氏阳性菌)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、芽孢杆菌目(Bacillales)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)。短小芽孢杆菌普遍存在于土壤及植物体表，也是人、动物肠道内常见的共生菌之一。短小芽孢杆菌是1989年美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)公布的44种可直接饲喂且通常认为是安全的微生物之一。短小芽孢杆菌分泌蛋白能力强且胞外蛋白酶活性低，因此具有分泌表达外源蛋白的天然优势，利用它们可望建立高效的原核分泌表达系统。

短小芽孢杆菌和其它芽孢杆菌一样，具有营养体-芽孢-营养体的独特生活周期史，抗逆能力强、繁殖速度快、营养要求简单，具有可抵抗酸、高温、干燥等不良环境条件等优势，适宜大规模产业化发酵生产。短小芽孢杆菌在生长过程中可分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、几丁质酶、脂肪酶、麦芽糖酶、多聚糖降解酶、碱性蛋白酶、β-半乳糖苷酶、果聚糖酶等多种酶类，其丰富的胞外酶系不仅有助于饲料的消化吸收，可降解内外环境中的有机残余物，促进良性生态循环。短小芽孢杆菌的防病能力源于对养殖对虾体内外生态环境的改善和机体免疫力的提高，将其应用到水产养殖环境改良剂、饲料添加剂等有广阔的前景。

但目前对虾养殖生产中应用的短小芽孢杆菌菌株较少，且存在着菌种生物学性状平平，活菌数量偏低，作用效果不稳定等不足，特别是还没有抗对虾病毒病菌株的应用。病毒性疾病是危害对虾养殖生产的主要病害，约占对虾病害总损失率的六成；特别是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，简称WSSV)引起白斑病，由于宿主范围广、感染死亡率高，是我国乃至全世界影响最大、危害最为严重的病毒性疾病。本发明涉及的短小芽孢杆菌菌株，优先考虑菌株的抗病毒活性，通过反复养殖实验证实该菌株可提高对虾溶菌酶、过氧化氢酶、酚氧化酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相关免疫酶活性，增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会，从而有效阻断病毒病的发生与流行。

发明内容

本发明的目的是提供一种短小芽孢杆菌菌株及其应用，该菌株来源于对虾消化道，具有增强对虾细胞和体液的免疫水平，特别是提高对虾抗病毒感染能力的生物学活性。

本发明的短小芽孢杆菌LV012(Bacillus pumilus LV012)菌株于2013年6月16日保藏在武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2013263。

上述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV012菌株是从对虾消化道中分离的。

短小芽孢杆菌LV012菌株可用于制备短小芽孢杆菌LV012发酵菌液。

短小芽孢杆菌LV012发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中短小芽孢杆菌LV012活菌浓度≥10⁹CFU/mL。

短小芽孢杆菌LV012的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.5％；酵母粉，0.1％；蔗糖，1.5％；氯化钠，2.5％；硫酸铁，0.05％；硫酸镁，0.004％；硫酸锰，0.01％。

本发明的短小芽孢杆菌LV012筛选自对虾消化道，具有：①改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；②通过提高对虾溶菌酶、过氧化氢酶、酚氧化酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相关免疫酶活性，增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会；③激活对虾酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、热休克蛋白、脂多糖-葡聚糖结合蛋白、信号传导及转录激活因子等与抗病原感染相关分子的表达，减缓病毒在对虾体内的增值速率；④提高对虾蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进对虾消化能力和饲料养分的消化，提高对虾抗应激反应能力等多种生物学功能。本发明的短小芽孢杆菌LV012可以添加到对虾饲料原料中，也可以直接施用于对虾养殖水环境中。

具体实施方式