[发明专利]一种快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法。

背景技术

土壤中的微生物种类繁多，数量极大，一克肥沃土壤中通常含有几亿到几十亿个微生物，贫瘠土壤每克也含有几百万至几千万个微生物，一般说来，土壤越肥沃，微生物种类和数量越多。另外，土壤表层或耕作层中及植物根附近微生物数量也较多。土壤中的渐生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。土壤中的微生物以细菌数量最多，细菌占土壤微生物总量的70％～90％，而且种类多。

在土壤微生物研究中，过去的研究主要集中在土壤微生物DNA的提取以及其下游反应，土壤微生物DNA的提取可以适用于所有微生物的研究，然而却无法检测到当前有活性的微生物状态，基于土壤微生物RNA的分析能更好地描述种群的代谢活性。提取纯度高河完整性好的RNA是研究微生物表达组学的重要前提。目前国内外已经有很多专门用于土壤微生物RNA提取的方法，主要分成两类，一类是依据特殊的溶液来提取RNA，另一类是根据离心柱，然而这些试剂盒大多价格较为昂贵，且需要多次试验才能成功提取到土壤微生物RNA，这给小实验室进行土壤微生物RNA研究带来很大的经济负担。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能高效、快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种快速提取土壤微生物RNA的方法，包括如下步骤：

土壤样品的前处理：取0.1-1g的土壤于2ml的离心管中，加入50-200μl Buffer A，300-900μl无菌水，300-600μl Buffer B，涡旋震荡30-60s，加入50-200μl Buffer C，100-300μl Buffer D，涡旋震荡30-60s，8000-10000g离心1-5min，去上清得沉淀A；

所述Buffer A为pH为5-6的0.5-2M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al³⁺离子的溶液；

所述Buffer C为包含2-6M的OH^-离子的溶液；

所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-0.5M的Tris-Cl缓冲液；

土壤微生物RNA的提取：所述沉淀A加入200-400μl Buffer D，0.1-1g的0.5-1mm玻璃珠，200-400μl Buffer E，200-400μl Buffer F，涡旋震荡1-3min，4℃温度条件下10000-12000g离心2-5min，取500-800ul上清液至1.5ml离心管，加入500-800μl的酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡旋震荡30-60s，4℃温度条件下14000-16000g离心1-5min，将上清液转移至1.5ml离心管，加入上清液等体积的Buffer G混匀后得样品，将样品加到RNA吸附柱上，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，加入500-600ul去蛋白液，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，加入500-600ul漂洗液，14000-16000g离心1min，去掉液体，再加入500-600ul漂洗液，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，吹干后加入30-50ul洗脱液，14000-16000g离心2-5min，收集液体得RNA溶液；

所述Buffer E为10-20％的SDS溶液；

所述Buffer F的配制方法为：取2-3g LiCl，1-2g Tris，3-4g EDTA，加入双蒸水溶解并调节pH为7.0-9.0，定容至100ml；

所述Buffer G为溶质重量百分数为50-80％的乙醇溶液；

所述去蛋白液为pH为6-7的包含4-6M盐酸胍，10-30 mM Tris-HCI的溶液，所述蛋白液中乙醇的重量百分数为30-50％；

所述漂洗液为pH为7-8的包含10-30mM NaCL，1-3mM Tris-HCI的溶液，所述漂洗液中乙醇的重量百分数为80-90％；

所述洗脱液为pH为6-7的5-15mM Tris-HCI溶液。