[发明专利]一种来源于绿色巴夫藻的delta8去饱和酶新基因

说明书

技术领域

 本申请属于基因克隆分离的技术领域，尤其涉及于一种来源于微藻的有关多不饱和脂肪酸合成的去饱和酶基因及其分离方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸是人体必需的重要的营养物质，微藻因富含多不饱和脂肪酸而成为重要的生物资源。绿色巴夫藻 (Pavlova viridis)含有丰富的EPA （二十碳五烯酸）与DHA（二十二碳六烯酸），是进行多不饱和脂肪酸相关合成基因识别与克隆的良好实验材料。

RACE全称rapid-amplification of cDNA ends，是一种常用的通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。本实验采用RACE技术来获得目的mRNA片段的全长序列。

在微藻的EPA和DHA的体内合成途径中，起到最关键作用的是多不饱和脂肪酸去饱和酶和多不饱和脂肪酸延伸酶两大酶类。但由于其为与内质网结合的膜蛋白，上述酶类在分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta8去饱和酶是催化二十碳三烯酸生成二十碳四烯酸的关键酶，该酶与delta9延伸酶一起构成了由亚麻酸生成EPA的旁路，该路径因其可避开常规路径中的产物阻遏作用而具有较大的研究价值。目前在微藻中已经有数个来自于不同物种的delta8去饱和酶获得了分离和识别，但不同物种的同源酶显然都存在序列上和结构上的差异，进而导致其酶活性和功能的不同。因此，从绿色巴夫藻中分离得到其delta8去饱和酶的同源酶是对该部分研究资源的很好补充，本申请就试图从这个角度展开相关的工作。

发明内容

绿色巴夫藻 (Pavlova. viridis) 为常用微藻，购自中国科学院青岛海洋研究所。

绿色巴夫藻delta-6去饱和酶基因的分离过程为：

(1) 利用本领域常规的mRNA提取分离手段获得绿色巴夫藻的总mRNA，并使用引物OligodT以本领域常规手段将之反转录为cDNA;

(2) 使用cDNA作为模板，根据delta8去饱和酶同源基因的保守性设计引物P8F、P8R来进行保守区基因的扩增,其引物序列为:P8F：5’-CGTACGGGAGCGAGGCGCTG-3’; P8R: 5’-CCCTGGATAGCTTTAGACGTG-3’; PCR反应条件为：94oC 3 min；94oC 30 s, 58oC 30 s, 72oC 1 min, 30个循环；72oC 10 min; 所获PCR产物大小约为530bp；

(3) 3’末端的扩增反应以cDNA为模板、使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒来进行，使用的扩增引物分别是：UPM (10×universal primer mix); des8-3 CATGCGATACATGCCCACG。梯度PCR反应程序为: 94oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min, 5个循环；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5个循环；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3 min， 30个循环；72oC 10 min。所获PCR产物大小约为 650 bp.

（4）5’末端的扩增反应使用总mRNA为模板并使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒来进行，使用的引物分别为：UPM5’(10×universal primer mix); GSP1 GCGTCTCGCTCGCGTCCCT; GSP2

TCCCCCGTCGTATCACTC。反应程序为：加入GSP1于mRNA中后以94oC 3 min; 94oC 30 s, 60oC 30s, 72oC1 min反应1个循环；随后加入TdT于37oC反应30min获得特定末端产物；然后向体系中加入UPM5’和GSP2, 以如下程序完成反应：94oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min, 5个循环；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5个循环；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3 min， 30个循环；72oC 10 min。所获目的片段约为260bp。

以上所有的片段均连入pMD18T载体后进行测序后拼接。