[发明专利]过氧化氢酶活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种过氧化氢酶活性的检测方法，属于酶活性检测方法领域。

背景技术

随着科学的发展和社会的进步，过氧化氢酶(ECl.11.1.6)的用途越来越广泛。它较多分布于动植物细胞内，需氧微生物代谢过程也会有大量的过氧化氢酶产生，其产生和存在是一动态过程。动物肝脏细胞代谢产生的过氧化氢多，此酶也有大量积蓄，从动物肝脏提取是制备过氧化氢酶的一个重要途径；细菌和霉菌在发酵过程中也会有大量的过氧化氢酶释放于胞外，积蓄于发酵液中，通过生化制备方法得到纯度较高的可应用于工业和医学界的过氧化氢酶。

过氧化氢是一种强氧化剂，目前已在纺织业较多应用漂白脱色，而多余的过氧化氢可用过氧化氢酶去掉，这样做非常符合于环保的要求。医学上也可用低浓度过氧化氢清除坏死组织，然后再用过氧化氢酶反应多余的过氧化氢。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶复合制剂还可用于防治动物肠道、胃部由细菌引起的一些疾病。因此过氧化氢酶的酶活力测定对于研究和应用此酶的领域显得十分重要。

目前应用较多的测定方法是滴定法、紫外速率法等，这几种方法在一般操作应用中都会受到某种条件限制。因此研究一种准确度高、重复性高、操作简便、适用于常规条件下的操作的过氧化氢酶活性的检测方法很有必要。

发明内容

本发明旨在提供一种准确度高、重复性高、操作简便、适用于常规条件下的操作的过氧化氢酶活性的检测方法。

所述的过氧化氢酶活性的检测方法，包括以下步骤：

将过氧化氢酶标准品稀释成一系列酶活性浓度的标准液，取10mL过氧化氯磷酸缓冲液于100mL碘量瓶中，置25℃水浴中保温，然后加入2mL酶标准液，准确保温3min，立即加入2mL0.5mol/硫酸终止反应，对照反应液对照管先加2mL0.5mol/L硫酸终止反应后加酶液。然后取上述反应液0.1mL加2.9mL过氧化物酶-邻联茴香胺溶液于测试管中摇匀，在25℃下用分光光度计在436μm处先用空白试测管调零后再测定各反应液测试管的吸光度，得到标准酶活性与吸光度关系曲线。按上述相同的方法处理测试酶，根据其吸光度与标准曲线可得到测试酶的酶活性。

优选的，本发明所述的过氧化氢磷酸缓冲液配制方法为取1mL30％过氧化氢，用0.01mol/L、pH6.8磷酸缓冲液稀释到1000mL。

更优选的，本发明所述的过氧化物酶-邻联茴香胺溶液为0.03％过氧化物酶和1％邻联茴香胺甲醇溶液。

本发明所述的检测方法，其原理是过氧化氢酶催化过氧化氢分解生成氧和水。剩余的过氧化氢在有氧供体存在下用过氧化物酶催化反应，氧供体即邻-联(二)茴香胺被氧化成棕色产物，于436μm处测量吸光率，并推算出酶活性。

本发明所述的检测方法，经测定，从标准底物浓度OD值的曲线显示，酶活性在23～69u/mL范围内，随着酶活力增加而OD值下降，呈良好的线性关系，曲线关系分辨率良好。酶活力在70u/mL以上，OD值下降很快，曲线关系分辨率下降；酶活力在22u/mL以下，OD值下降过缓，曲线关系分辨率很低。为此，本发明所述的检测方法适用于酶活性为23～69u/mL之间的酶液的酶活性检测。其标准品测定回收率为99.37％。

本发明所述的检测方法具有准确、实用性强、仪器要求简单，适用于常规条件下的操作的特点，是测定过氧化氢酶活力显色法中一种可靠方法。

具体实施方式

实施例一：

标准酶液配制：将过氧化氢酶标准品稀释成一系列酶活性浓度的标准液，备用。

过氧化氢磷酸缓冲液配制：取1mL30％过氧化氢，用0.01mol/L、pH6.8磷酸缓冲液稀释到1000mL，备用。

过氧化物酶-邻联茴香胺溶液配制：取0.3g过氧化物酶和10g邻联茴香胺溶于1000mL的甲醇溶液中，备用。

取10mL过氧化氯磷酸缓冲液于100mL碘量瓶中，置25℃水浴中保温，然后加入2mL酶标准液，准确保温3min，立即加入2mL0.5mol/硫酸终止反应，对照反应液对照管先加2mL0.5mol/L硫酸终止反应后加酶液。然后取上述反应液0.1mL加2.9mL过氧化物酶-邻联茴香胺溶液于测试管中摇匀，在25℃下用分光光度计在436μm处先用空白试测管调零后再测定各反应液测试管的吸光度，得到标准酶活性与吸光度关系曲线。按上述相同的方法处理测试酶，根据其吸光度与标准曲线可得到测试酶的酶活性。