[发明专利]表达PTD-CD46融合蛋白的重组工程菌及应用

说明书

发明所属领域：

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种表达PTD-CD46蛋白的重组工程菌，以及用该菌表达的PTD-CD46融合蛋白在提高猪瘟病毒培养效价上的应用。

技术背景

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种急性、发热性、致死性传染病。该病具有高度接触传染性，曾在国际上广泛流行，发病率高，死亡率高达90％以上，危害极大，给当时的养猪业造成巨大的经济损失，被世界卫生组织(OIE)列入重要畜禽传染病名录。目前，我国是世界上猪瘟疫苗生产和使用最多的国家，每年的总消耗量约为40亿头份以上，市场总价约为20亿元人民币。

长时间的疫苗免疫以及其他疫病的干扰，猪对猪瘟疫苗正在逐渐甚至逐代产生了耐受能力，其应答反应减弱或变慢，致使近年来猪瘟疫苗免疫失败的情况经常出现，温和型猪瘟、亚临床症状猪瘟不断流行，每年因此给我国养猪业造成近100亿元经济损失。这种形势对猪瘟疫苗的质量提出了新的要求，亟需提高我国猪瘟疫苗的效价。

猪瘟疫苗的效价与猪瘟病毒的培养过程有着极其密切的关系，猪瘟病毒依靠与敏感细胞的表面受体结合进入细胞，在细胞内扩增再释放于培养液中[王镇，陆宇，周鹏程，等.猪瘟病毒在PK细胞和MPK细胞中繁殖过程的研究[J].微生物学报，1999,39(3):189-194.]。但在培养过程中，即使是处于同一培养容器中的同种细胞，并非所有的细胞个体都对接种的病毒易感，这也就是说，同一培养容器中的细胞接种病毒后，并非所有的细胞体内都会有病毒进入扩增，而且猪瘟病毒培养时，只有少部分细胞有病毒进入，大多数细胞是在随着培养时间的延长而慢慢增加进入病毒的细胞数量[王镇，陆宇，丁明孝.猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中增殖特性的研究[J].中国病毒学，2000,15(23):170-179.]。这就造成了两个结果：1、培养起始阶段，参与扩增病毒的细胞较少，病毒效价难以升高，2、细胞扩增病毒的速度不同步，在培养温度下，先从细胞中释放出来的病毒活力下降，这使得培养液达到标准毒价的时间延长。因此，我们认为：如何使同一培养容器中接种的病毒在尽可能短的时间内进入最多的细胞个体中扩增，将可能是获得高效价猪瘟病毒的关键。

PTD是一种膜转导蛋白，也叫穿膜蛋白，该类蛋白可以自由出入细胞膜，人们使用该类蛋白将某些不能透过细胞膜的药物带进细胞膜内取得了理想的效果，而CD46蛋白则是猪瘟病毒特异性受体，能在培养液中特异性捕获猪瘟病毒。本发明专利将这两种蛋白用基因表达的方式连接起来，依靠CD46蛋白捕获培养液中的猪瘟病毒，再依靠PTD蛋白的穿膜作用将捕获的猪瘟病毒带入细胞内，使培养体系中在短时间内将猪瘟病毒强行导入尽可能多的细胞内扩增，达到大幅度提高猪瘟病毒培养效价的目的。

发明技术内容：

本发明的一个目的是表达PTD-CD46融合蛋白的重组工程菌，该菌表达的PTD-CD46融合蛋白能有效提高猪瘟病毒在细胞内的增殖效果，提高病毒培养的毒价。

本发明的另一个目的是提供一种制备表达PTD-CD46融合蛋白的重组工程菌的方法。

本发明的再一个目的是提供重组工程菌表达的PTD-CD46融合蛋白的应用

本发明公开了一个新的一种表达PTD-CD46融合蛋白的重组工程菌，其特征在于，该细菌含有人工转入的PTD-CD46基因，且PTD-CD46基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该细菌是大肠杆菌PTD-CD46/BL21(E.coli PTD-CD46/BL21)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014502，保藏日期是2014年10月24日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，是中国专利局指定的保藏机构，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，网址：www.cctcc.org,电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。在本发明公开后，不以赢利为目的的研究者可依法向保藏中心索取本微生物菌种再现本发明。

在本发明中，PTD-CD46融合蛋白是膜转导蛋白-CD46受体蛋白的融合蛋白，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列表达产生。

本发明还公开了制备重组工程菌的方法，该方法包括如下步骤：

1)基因合成：根据GeneBank上公布的基因序列人工合成54对引物作为模板，用来人工合成PTD-CD46基因；