[发明专利]寡核苷酸序列及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及哈维氏弧菌的识别检测，尤其是涉及可用于灭活哈维氏弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用。

背景技术

在养殖业中，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。

目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体。由于制备技术要求较高、周期较长，因此其应用受到限制。

指数富集配体进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。

SELEX技术的出现为微生物的快速检测提供了新的研究思路，其应用也将越来越广泛。在SELEX筛选中，以灭活菌为靶目标进行筛选，不仅具有较好的安全性，而且使目标菌的形态相对稳定和固定，从而有效提高了筛选的效率和效果。同时，以灭活菌为靶目标，还能有效避免环境因子对活菌的影响，使筛选的稳定性得到较好的改善。因此，开展以灭活菌为靶目标的SELEX筛选，具有重要意义。

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖中的重要条件致病菌，它不仅能引发多种水产动物发病，还可以通过食物链引起食物中毒，威胁到人类的健康。因此，运用SELEX技术筛选灭活哈维氏弧菌适配子，并将其应用于灭活哈维氏弧菌的识别鉴定，能大大提高哈维氏弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本发明的重点。

本申请人在中国专利201110259244.8中已公开了3条适配子序列，分别如下：

序列1：5′-GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′；

序列2：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTCCC TCTTGTGC-3′；

序列3：5′-GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGG AGACGGCGAA GCGACTGA-3′。

本申请人在中国专利201110090419.7中已公开了4条适配子序列，分别如下：

8号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGT GAACGGAGGG GGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

10号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAA GGACTGTGTC GAGTGTTG GC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

37号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTA GGAGGGCCAC AGTGGACT GCACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3′

46号适配子：5′-TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCT CCTTCCCTCT GGGGTCTC-3′。

本申请人在中国专利201210079530.0中已公开了4条适配子序列，分别如下：