[发明专利]一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

一种高特异性的利巴韦林人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

利巴韦林为抗病毒药物，是广谱强效的抗病毒药物，由于其毒副作用强，易引起免疫系统损伤和致畸。早在2005年农业部就明确规定禁止利巴韦林等抗病毒兽药的销售和使用。

2012年底媒体曝出了“速生鸡”事件，某些肉鸡养殖企业违反国家兽药管理条例，在养殖过程中喂食利巴韦林等人用抗病毒药品，引起了人们极大的关注。目前我国对于动物源性食品中利巴韦林残留量检测的相关研究报道甚少，更未制定或立项国家标准和行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。因此，建立快速检测利巴韦林在动物组织中残留量的方法已迫在眉睫。

利巴韦林的化学结构式如式I所示。

 

(式I),

目前我国对利巴韦林的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是利巴韦林检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

本发明的半抗原是在利巴韦林分子的5-号位羟基一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的利巴韦林羧基衍生物，该衍生物为利巴韦林半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联最后形成完全抗原。

发明内容

本发明的目的：针对现有利巴韦林抗原合成技术的空白，提供一种新型的利巴韦林半抗原和完全抗原合成方法，使得制备高特异性的利巴韦林单克隆抗体成为可能。

本发明提供的利巴韦林半抗原化合物，具有式Ⅱ所示分子结构。

本发明的技术方案：

合成路线及方案如下：一种利巴韦林半抗原，其分子结构式如式Ⅱ所示

（式Ⅱ），

利巴韦林半抗原合成反应方程式为：

其是由利巴韦林为原料，在利巴韦林分子的5-号位羟基一端接出活性羧基，得到单一特异性结构的利巴韦林羧基衍生物，该衍生物为利巴韦林半抗原。

一种利巴韦林完全抗原，是所述利巴韦林半抗原与载体蛋白的偶联物。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS中的一种。

所述的利巴韦林半抗原的制备方法，包括如下步骤：100mg利巴韦林溶解于5mL无水DMF和5mL无水吡啶的混合液中，加入50mg琥珀酸酐后，60℃水浴反应12h，最后于pH3酸性条件0℃下重结晶生成利巴韦林半抗原。

所述的利巴韦林完全抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）将利巴韦林半抗原，用超纯水溶解，与NHS，EDC按摩尔比为1: 2: 2混合，在室温25℃下搅拌反应12h进行活化；取牛血清蛋白，利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL；将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原；

或（2）将利巴韦林半抗原，用超纯水溶解，与三正丁胺, 氯甲酸异丁酯按摩尔比为1: 1.5: 1.5混合,  0℃反应1h进行活化；取牛血清蛋白，利巴韦林半抗原与牛血清蛋白的摩尔比为60:1，用 0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的蛋白浓度大于3mg/mL；在0℃条件下，将活化的利巴韦林半抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到利巴韦林完全抗原。

所述利巴韦林完全抗原的制备方法，所述载体蛋白牛血清白蛋白BSA被替换为匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HAS之一种。

所述利巴韦林完全抗原的应用，在制备利巴韦林抗体中的应用，免疫动物得到抗体。

所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。

所述抗体在检测利巴韦林中的应用。

得到的利巴韦林完全抗原，将利巴韦林完全抗原透析，然后进行丙烯酰胺凝胶电泳鉴定（图1）。