[发明专利]一种检测JUMPY基因11号外显子突变的方法及探针

权利要求书

1.一种用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、合成检测所需的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如SEQ ID NO:1所示：5’-CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3’；所述下游引物的基因序列如SEQ ID NO:2所示：5’-ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3’；合成特异性探针，其基因序列如SEQ ID NO:3所示：5‘FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-NFQ-3’；

(2)、合成阻断核酸，其基因序列如SEQ ID NO:4所示：5‘VIC-TGGGATCAGACCC C-MGB-NFQ-3’；

(3)、对待检测样品进行处理并提取DNA；

(4)、配制荧光定量PCR反应体系A，对待测样品上样量进行监测，利用引物对和特异性探针扩增待测样品，得到样品DNA的检测Ct值，作为样品的质控Ct值；

(5)、配制荧光定量PCR反应体系B，对待测样品进行PCR扩增检测，利用阻断核酸抑制待测样品中存在的野生型DNA即未发生JUMPY基因11号外显子突变的DNA，利用引物对和特异性探针扩增待测样品中可能存在的JUMPY基因11号外显子无义突变DNA，得到样品DNA的突变检测Ct值；

(6)、以质控Ct值作为上样量是否适当的标准，质控Ct值＜30则上样量合适，检测结果有效；30≤质控Ct值≤34则上样量偏低，可适当提高上样量后检测；以突变检测Ct值与质控Ct的差值△Ct值作为JUMPY基因11号外显子是否发生无义突变的判断标准，△Ct值≤6则样品存在突变，△Ct值＞6则样品无该突变或低于突变检测下限。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的荧光定量PCR反应体系A包括PCR缓冲液、上游引物、下游引物、特异性探针、Taq酶、样品DNA以及水，其中PCR缓冲液的体积浓度为50-60％，上游引物和下游引物的浓度均为0.2μM-1μM，特异性探针的浓度为0.1μM-0.5μM，Taq酶的酶活力为0.5U-1.0U，样品DNA的体积浓度为8-20％。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)中所述的荧光定量PCR反应体系B包括PCR缓冲液、上游引物、下游引物、特异性探针、阻断核酸、Taq酶、样品DNA以及水，其中PCR缓冲液的体积浓度为50-60％，上游引物、下游引物和阻断核酸的浓度均为0.2μM-1μM，特异性探针的浓度为0.1μM-0.5μM，Taq酶的酶活力为0.5U-1.0U，样品DNA的体积浓度为8-20％。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)和(5)中PCR扩增反应步骤为：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；每个循环后收集FAM或VIC荧光信号。

5.权利要求1中所述的用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的基因探针，其特征在于：该探针的基因序列如SEQ ID NO:3所示：5‘FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-NFQ-3’。

6.权利要求1中所述的用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的引物对，其特征在于：包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如SEQ ID NO:1所示：5’-CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3’；所述下游引物的基因序列如SEQ ID NO:2所示：5’-ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3’。

7.权利要求1中所述的用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的阻断核酸，其特征在于：所述阻断核酸的基因序列如SEQ ID NO:4所示：5‘VIC-TGGGATCAGACCCC-MGB-NFQ-3’。