[发明专利]脊髓灰质炎灭活疫苗及其生产方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种脊髓灰质炎灭活疫苗及其生产方法，具体是一种应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，以及利用该方法生产得到的脊髓灰质炎灭活疫苗。

背景技术

脊髓灰质炎(简称脊灰)是由脊髓灰质炎病毒感染所引起的、以肢体麻痹为主的急性肠道传染病。脊髓灰质炎的主要易感人群为儿童。目前仍然没有有效的治疗脊灰的方法，控制与消灭脊灰最重要的是有效的脊髓灰质炎疫苗。

国内外已应用的脊髓灰质炎疫苗有两种：口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(Oral poliovirus vaccine，OPV)和灭活脊髓灰质炎疫苗(Inactivated poliovirus vaccine，IPV)。其中，IPV不会产生疫苗相关麻痹型脊灰(Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis,VAPP)及疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-Derived Poliovirus,VDPV)引起的脊髓灰质炎病毒循环iVDPV感染，且IPV可与其他疫苗联合使用；并且，由于OPV对于有免疫缺陷的儿童会引起一定比例的脊髓灰质炎，WHO建议在全球证实消灭脊灰后尽早停止OPV的使用。因此，对于IPV的研究迫在眉睫。

传统的灭活脊髓灰质炎疫苗是采用发酵罐或转瓶工艺生产，相关工艺可参见CN1647822A、CN1297314C等，采用传统工艺，每批次的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，较难控制，且存在劳动强度大、占地空间大、隐性污染引起高内毒素的隐患大、细胞生长环境(温度、pH值、溶氧等)不易控制、细胞生长密度低等缺点。

近年来，利用生物反应器培养细胞的技术日趋成熟。目前已有关于以Sabin减毒株作为生产用毒种、以Vero细胞的微载体生物反应器培养技术生产灭活疫苗的技术报道，但该现有技术生产的疫苗安全性尚存在争议。CN102406928A公开了一种人二倍体细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其中采用多级微载体生物反应器扩增传代培养人二倍体细胞，每级生物反应器的细胞生长达到10⁶个/ml以上浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照1：10～1：20的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模，再接种脊髓灰质炎病毒、增殖培养、收获病毒培养液并进行纯化和灭活，但该技术生产的收获液病毒滴度较低，且并没有公开具体的培养条件。

目前并未有应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质高效生产高质量脊髓灰质炎灭活疫苗的技术报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质高效生产高质量脊髓灰质炎灭活疫苗的方法。

为达到上述目的，本发明提供了一种应用篮式生物反应器生产Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方法。事实上，以Vero细胞为基质接种脊髓灰质炎病毒的培养条件相对较难控制。发明人经过反复摸索实验，最终确定了有利的细胞培养条件和脊髓灰质炎病毒繁殖条件，成功地制备出了以Vero细胞为基质的脊髓灰质炎灭活疫苗，该疫苗具有良好的稳定性。根据本发明所提供的应用篮式生物反应器制备Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，其工艺步骤主要包括：细胞接种、洗换、病毒接种、病毒液收获。具体地，本发明的应用篮式生物反应器生产Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方法包括步骤：

在篮式生物反应器中加入M199培养基作为细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换；

洗换结束后注入M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，病毒接种MOI为0.01～0.3，继续培养，病毒培养温度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培养阶段体系pH值为7.4～7.6；

病毒接种后培养42～72小时，收获病毒液。

根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法还包括：

收获的病毒液经适当稀释后配制脊髓灰质炎灭活疫苗，配制后冻干，即为Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗制品。

根据本发明的具体实施方案，本发明的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，所述脊髓灰质炎病毒为I型、II型、或III型脊髓灰质炎病毒。具体而言，I型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养48-66小时，II型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养30-54小时，III脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养42-72小时。