[发明专利]固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种固相片段法制备猪O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法。

背景技术

猪O型口蹄疫合成肽抗原2700结构式如下：

猪口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。近年来，口蹄疫在我国的江苏，四川，东北三省，内蒙古大面积的爆发，造成了巨大的经济损失。目前，免疫接种仍然是控制该病的主要手段。传统的灭活疫苗仍然是国内外口蹄疫防治的主导方法，但容易引发过敏等副反应，而且还有生物安全方面的问题。因此国内外对新疫苗进行了大量的研究，近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，口蹄疫病毒(FMD)基因工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现。但这些新技术疫苗都只针对口蹄疫抗原蛋白的一级结构，同时对细胞免疫考虑不足，使其不能对口蹄疫病毒这样依赖于抗原空间结果和T细胞苗裔的病毒产生良好的免疫效果。

VP1是口蹄疫病毒的四种结构蛋白之一。VP1氨基酸序列中包含129～169位氨基酸的多肽最具免疫效力。结合国家口蹄疫参考实验室和英国Pirbright世界口蹄疫参考实验室所提供的口蹄疫氨基酸序列数据库，我们对所得到的O型口蹄疫病毒各拓扑型的VP1序列(129～169)逐一比较。免疫试验结果表明，所有VP1都具有相同的免疫效力。多肽抗原2700是依据OZK/93毒株设计，OZK/93归属于老猪毒，为我国最近10多年来猪O型口蹄疫疫苗的经典制苗毒株。该毒株抗原谱广，对细胞、本动物适应性好，为疫苗毒株的优秀代表。同时为了使设计的疫苗适用于大、中型动物，在VP1序列(129～169)上结合T细胞辅助表位(T-helper)结构形成猪O型口蹄疫2700多肽抗原。

T辅助细胞表位(T-helper)是指一抗原上供T辅助细胞识别的氨基酸序列。T辅助细胞是指一类特定的T细胞，其作用是辅助T杀伤细胞从而使T杀伤细胞与目标抗原或细胞结合而消灭或杀死该目标抗原或细胞。T辅助细胞表位的实例包括但不限于，乙肝病毒表面和核心抗原T辅助细胞表位、百日咳毒素T辅助细胞表位、破伤风毒素T辅助细胞表位、麻疹病毒F蛋白T辅助细胞表位、沙眼衣原体主要外膜蛋白T辅助细胞表位、白喉毒素T辅助细胞表位、镰状疟原虫环孢子体T辅助细胞表位、曼森氏吸虫三糖磷酸盐异构酶T辅助细胞表位，及大肠杆菌TraT T辅助细胞表位。在猪O型口蹄疫2700多肽抗原的设计中最常用的是基于麻疹病毒的T辅助细胞表位。

通常在合成肽疫苗生产过程中，生产周期最长的是2700多肽抗原的合成，目前国内合成肽疫苗生产企业均采用二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-羟基-1H苯并三唑(HOBt)作为缩合剂，起始采用Rink amide MBHA树脂，采用Fmoc/tBu策略通过固相线性逐一缩合法最终得到目的抗原，尽管此种方法较液相合成有诸多优点，但是其在所有合成步骤中都存在不可逆副反应的风险，每个重复的合成循环中，反应不完全造成了错误序列和不完全的核心序列。假设每一个循环的产率为99.0％，10个循环以后的最高产率是90.4％，50个循环后混合物中则只有60.5％的产品。假如每一个循环的产率为95.0％，10个循环以后的最高产率是59.9％，50个循环后混合物中则只有7.69％的产品。在过去数年内尽管对大部分可能的副反应及其机制进行了大量的研究，但是，单步循环的产率还是达不到99.5％以上，每一步剩余的0.5％累积为污染产品的副产物。因此，目标肽很容易被一系列结构和化学性质类似的化合物污染，如差向异构形成的非对应异构体、错误序列和不完全的核心序列等。