[发明专利]一种嗜压菌处理深海溢油的方法

权利要求书

1.一种处理深海溢油嗜压菌的筛选方法，其特征是在于以下几个步骤：

步骤一：土著菌菌源采集

取海上溢油区域海底受石油污染的沉积物作为石油降解土著菌菌源；

步骤二：嗜压石油降解菌的筛选，具体步骤如下：

(1)将从采样点采集的沉积物2g加入盛有100mL无菌海水配制的LB培养基的锥形瓶中，LB培养基的配制为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min，将其置于0.3-0.4MPa的加压装置中28℃培养，经梯度驯化筛选得到嗜压菌菌液；

(2)取筛选得到的嗜压菌菌液中取出5mL，加入盛有100mL富集培养液A中，富集培养液A的配制为：75％LB培养基+1g/L原油+海水定容至100mL，28℃，置于0.3-0.4MPa的加压装置中培养；

(3)待富集培养液A浑浊时，取5mL接至100mL富集培养液B中，富集培养液B的配制为：50％LB培养基+2g/L原油+海水定容至100mL，28℃，置于0.3-0.4MPa的加压装置中培养；

(4)待富集培养液B浑浊时，取5mL接至100mL富集培养液C中，富集培养液C的配制为：25％LB培养基+3g/L原油+海水定容至100mL，28℃，置于0.3-0.4MPa的加压装置中培养；

(5)待富集培养液C浑浊时，取5mL接至100mL富集培养液D中，富集培养液D的配制为：4g/L原油+海水定容至100mL，28℃，置于0.3-0.4MPa的加压装置中培养，得到以石油为唯一碳源的石油烃降解嗜压菌，保存至20％的甘油溶液中，-20℃保藏；

步骤三：载体载菌

(1)取步骤二中筛选得到的石油烃降解嗜压菌菌液2mL，接至100mL的LB培养基中，把灭菌的多孔氧化锆投入，28℃，150rpm摇瓶培养；

(2)根据土著菌生长曲线，石油烃降解嗜压菌在26小时达到对数生长期，此时氧化锆载体载菌过程结束，得到载菌活性最大时期的氧化锆载体，载菌量为1.1×10⁸-1.2×10⁸cfu/个；

步骤四：石油降解嗜压菌-多孔氧化锆共载体的原油降解率测试

(1)每个浓度梯度各取50ml的三角烧瓶14个，按照1g/L,3g/L和5g/L浓度梯度分别向无机盐培养液中添加被原油重量25％的消油剂溶解的原油，配制以不同原油浓度作为唯一碳源的母液，超声使原油与无机盐尽可能混合均匀，取不同浓度梯度的原油溶液20ml分装到50ml的三角烧瓶中，封口后进行灭菌；

(2)待温度降到室温之后，向每个实验三角烧瓶中各添加入1块按照步骤三方法载菌的多孔氧化锆载体，三个不同浓度的对照三角烧瓶中各添加3块已灭菌的未载菌的多孔氧化锆载体，置于0.3-0.4MPa的加压装置中放入25℃人工气候箱中进行降解；

(3)每隔5d从3个浓度梯度的实验三角烧瓶中每次取出两只三角烧瓶连同烧瓶中的多孔氧化锆载体一起置于100ml的离心管中，在超净工作台中先用石油醚冲洗每支烧瓶上附着的原油，尽量减少原油的附着，并将洗液倒入离心管中；向各离心管中分别加入石油醚至50ml，萃取、超声各30min，3500r/min离心10min，取各实验离心管中的上层液体；

(4)将每个浓度梯度下实验离心管中的上层液体置于质量已知的恒重小试管m₁中，60℃旋转蒸发至石油醚完全挥发，取出小试管，室温下称其重量m₂；同样将对照组离心管中的上层液体置于恒重小试管m₃中，60℃旋转蒸发至石油醚完全挥发，取出小试管，室温下称量小试管的重量m₄，每个浓度梯度下的对照组有三支小试管，取3个小试管中蒸发前后重量差的平均值，记为m₀；

原油降解率的计算公式如下：

2.根据权利要求1所述的一种处理深海溢油嗜压菌的筛选方法，其特征在于：富集培养液A、B、C和D所含LB培养基的比例分别为75％、50％、25％和0，对应的原油浓度为1g/L、2g/L、3g/L和4g/L，其中LB培养基的配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，海水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。