[发明专利]10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测细胞活性的荧光探针及其应用。

背景技术

药物、环境污染、温度、离子应激、放射污染或其他生物调节和潜在的不利因素都会对细胞或机体组织产生损害。细胞活性、细胞毒性测定在评价细胞或组织因上述原因导致的细胞改变时非常重要，细胞膜的完整性被广泛的用于细胞活性测定，保护细胞的细胞膜的丢失导致细胞结构、胞浆物质、细胞离子梯度和膜电位等的丧失，细胞膜完整性的丢失将不可避免的导致细胞死亡。

在细胞膜完整性和细胞活性之间没有等价的量化关系，一般情况下把拥有完整细胞膜的细胞归为“活细胞”，而把因有毒的细胞试剂导致的细胞膜不可逆损伤的细胞归为“死细胞”。当然有些细胞在死去的过程中还拥有细胞膜，这些是“将死细胞”，“将死细胞”实际上不是活细胞，它们不能继续被培养和传代，但是按照通常依赖于观测细胞膜的方法经常把“将死细胞”计为活细胞。

细胞膜失去完整性的一个共同特征是其允许极性小分子（分子量小于2000道尔顿）进出细胞质。细胞膜通透性的改变是很多细胞活性、细胞毒性评价方法的基础。最常用的用于检测细胞活性/细胞毒性的方法是放射性的铬⁵¹(⁵¹Cr)释放和非荧光的台盼蓝有色染料排出。荧光染料比普通有色染料有更高的检测灵敏度，也不需要如放射性元素那样要求有复杂的材料处理过程。可是，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针激发和发射波长都很短，容易受到细胞背景荧光干扰。例如，由于GFP（绿色荧光蛋白）的发射光谱与荧光素的发射光谱完全重叠，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针不可能被用于测定GFP细胞的活性。然而，由于它们长波长发射本发明的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针则可被用于检测GFP细胞的活性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种简便快速检测细胞活性的荧光探针。10-去氧碳代荧光素二乙酰脂（I）在中性pH水溶液中有非常好的可溶性和稳定性。10-去氧碳代荧光素二乙酰脂相对无色、没有荧光和具有很小的消光系数，然而,活细胞中脂酶可使10-去氧碳代荧光素二乙酰脂的双脂键断裂释放出10-去氧碳代荧光素（II）使溶液荧光和消光系数急速变强，可达10000倍以上。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种具有如下结构式的荧光探针：

（I）

R₁和R₂分别是H、COOH或COOCH₂OAc。

优选R₁是H；R₂是COOCH₂OAc或COOH。

优选R₁是COOH，或COOCH₂OAc；R₂是H。

本发明进一步公开了荧光探针的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：:

（1）合成带有保护基的蒽酮衍生物；

   

（2）蒽酮衍生物与溴代苯衍生物缩合给出10-去氧碳代荧光素；

 

(3)10-去氧碳代荧光素乙酰化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂；

 

其中的R₁和R₂分别是H或COOH；

(4)10-去氧碳代荧光素二乙酰脂进一步脂化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂羧酸脂; 

 

其中的R₁和R₂分别是H或COOCH2OAc。

本发明所述的步骤(2)中蒽酮衍生物与溴代苯衍生物的摩尔比为1比1~1.5，优选为1:1.25。

本发明更进一步公开了荧光探针在制备作为检测细胞活性、细胞毒性荧光探针中的应用。实验的结果表明采用本发明的荧光探针可以达到-降低细胞自身荧光干扰，使检测结果更加准确的目的。

结构（I）无色、无荧光；结构（II）红色、强烈红色荧光。这种无色、无荧光的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂是一种具有很好的光谱属性的不发荧光的底物。10-去氧碳代荧光素二乙酰脂具有一个高反应性双脂离去基团。另外活细胞中脂酶与10-去氧碳代荧光素二乙酰脂作用形成的10-去氧碳代荧光素产物（II）具有很好的稳定性。合成10-去氧碳代荧光素二乙酰脂需要经过四个步骤（见图1和图2）。

附图说明