[发明专利]一种耐酸的大肠杆菌工程菌

说明书

本发明公开了一种耐酸的大肠杆菌工程菌，属于遗传工程领域。本发明通过蛋白质组学方法，发现secretion neighborhood ATPase可能与产酸丙酸杆菌的耐酸性相关。采用分子手段，将来源于产酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)中编码secretion neighborhood ATPase的基因过量表达于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得一株secretion neighborhood ATPase高表达的重组菌，与对照菌株相比，对丙酸和乙酸的耐受性均有不同程度的提高。本发明的研究思路为揭示丙酸杆菌和大肠杆菌耐酸机制以及提高菌种发酵生产能力提供了依据与新思路。

技术领域

本发明涉及一种耐酸的大肠杆菌工程菌，属于遗传工程领域。

背景技术

作为一种重要的大宗化工产品，丙酸主要用途有作酯化剂、硝酸纤维素的溶剂、增塑剂、化学试剂和配制食品原料等。丙酸盐是丙酸的重要衍生物，是国际上公认的性能安全可靠的谷物、饲料和食品的防霉剂。随着饲料工业和食品工业的发展，丙酸的用量正逐年增加，其产量已远不能满足工业需求。

丙酸的生产方法有化学合成法和发酵法，化学合成法是以石油化工产品为原料，经过加温加压催化剂等合成，微生物发酵法是丙酸菌在常温常压下利用农副产品等代谢产生丙酸，目前工业生产方法主要是化学合成法。在当前全世界面临环境污染、能源短缺的情况下，用微生物发酵法来大规模生产丙酸是一条值得探索的新途径。微生物发酵法制备丙酸主要菌种为丙酸杆菌，但由于丙酸对丙酸杆菌的细胞生长和代谢活性有较强的抑制作用，因此产酸率很低。因此，如何有效地消除或减轻丙酸对微生物的反馈抑制作用是提高丙酸生产效率的重要科学问题之一，其中提高微生物对丙酸的耐受性能是一项重要的策略。

由于缺少有效的基因操作工具，目前尚不能实现对产酸丙酸杆菌的基因操作，无法在产酸丙酸杆菌中验证关键酶对菌体耐酸的作用。大肠杆菌作为细菌的模式菌株，有成熟的基因操作工具和技术，是验证蛋白耐酸相关性的理想宿主。同时，大肠杆菌的发酵过程中多伴随有乙酸的产生，因此也常受到酸性环境的压力，对其耐酸的研究也十分普遍。

本发明在大肠杆菌中过量表达产酸丙酸杆菌中耐酸相关酶基因(sec)以提高大肠杆菌的耐酸性，为大肠杆菌和产酸丙酸杆菌的耐酸和发酵提供了指导。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐酸的大肠杆菌工程菌，是以大肠杆菌为宿主，过量表达了产酸丙酸杆菌的Secretion neighborhood ATPase。

所述secretion neighborhood ATPase的氨基酸序列如NCBI GenBank:AFV90672.1所示。

编码所述secretion neighborhood ATPase的基因sec的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述产酸丙酸杆菌耐酸相关蛋白secretion neighborhood ATPase通过蛋白质组学的技术手段分析，含量在产酸丙酸杆菌耐酸菌株比原始菌株有显著的提高。

在本发明的一种实施方式中，以E.coli BL21(DE3)为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以pACYCDuet-1为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述酸是丙酸或乙酸。

在本发明的另一种实施方式中，所述酸是1g/L或2g/L的丙酸，或2g/L、4g/L的乙酸。

本发明还提供一种构建所述耐酸的大肠杆菌工程菌的方法，是PCR扩增得到sec目的片段，与载体pACYCDuet-1通过酶切位点Nco I与Hind III连接得到重组表达载体pACYCDuet-sec，将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中得到secretion neighborhoodATPase过量表达的重组菌E.coli BL21(DE3)-sec。