[发明专利]一种调控小尾寒羊动脉平滑肌发育的CSRP2基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊动脉平滑肌发育的CSRP2基因及其在绵羊疾病治疗中的应用。

背景技术

随着生活水平的不断提高，人们的膳食结构有了新变化，羊肉日益受到青睐，从而促进了养羊业的规模化发展，羊病的危害给养羊业带来极大损失，从分子生物学角度研究治疗羊病的方法越来越受到重视。

CRP家族是LIM结构域蛋白中一类蛋白家族，有四个成员分别是CRP1、CRP2、CRP3、TLP(Weiskirchen et al.,1995；Kirchner et al.,2001)，其中CRP2蛋白的编码基因CSRP2(Cysteine and glycine-rich protein2)高表达于血管平滑肌中，动脉表达量高于静脉，在血管平滑肌发育过程中主要在肌细胞分化和维持细胞结构方面有重要作用(Kihara T et al.,2011)。有研究报道称，CRP2蛋白的缺乏会造成血管内膜增生并增强动脉损伤后血管平滑肌细胞的迁移，并将CSRP2归类到平滑肌细胞(SMC)的标记基因一列(J.Herrmann et al.,2006)。

但到目前为止，尚未见到有关小尾寒羊CSRP2基因克隆和功能的研究报道，而其对于血管平滑肌生长和发育的调控作用更是未知。

发明内容

基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊平滑肌发育的CSRP2基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长899bp；该序列中的开放阅读框编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共编码193个氨基酸；该基因具有调控血管平滑肌发育的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为研究绵羊以及其他哺乳动物血管类疾病的分子药物提供科学依据，而该分子药物在治疗绵羊动脉损伤和检测心血管疾病方面应用前景广阔。

本发明所提供的调控平滑肌发育的CSRP2基因，cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CSRP2的cDNA序列长899bp，该序列中的开放阅读框编码193个氨基酸。

上述的CSRP2基因是通过如下方法获得的：

(1)小尾寒羊主动脉总RNA的提取和反转录：

采用TRIzol法提取小尾寒羊主动脉组织总RNA，提取的总RNA用核酸蛋白分析仪进行检测，要求总RNA吸光度OD260/280在1.8至2.0之间，并根据现有技术采用TaKaRa公司的RrimeScript^TM RT reagent Kit试剂盒反转录合成cDNA第一链；

(2)CSRP2基因cDNA序列保守区的扩增：

比对已有物种CSRP2基因的cDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤(1)中的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，克隆测序得到保守区序列；

(3)应用降落巢式PCR法对CSRP2基因cDNA序列的3′端进行扩增：

根据步骤(2)所得保守区序列设计CSRP2基因的3′特异性内侧和外侧引物；

以步骤(1)中提取的总RNA为模板，以OligodT-AP为引物，反转录获得cDNA第一链模板；

以3′特异性外侧引物和3′通用外侧引物采用降落PCR法以步骤(3)中cDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；

以3′特异性内侧引物和3′通用内侧引物采用同样降落PCR法，以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增；

对第二轮PCR产物经克隆测序得到CSRP2基因cDNA序列的3′端序列；

(4)应用RACE法对CSRP2基因cDNA序列的5′端进行扩增：

以步骤(1)中提取的总RNA为模板依次进行去磷酸化处理、“去帽子”反应、接头序列连接反应并以TaKaRa公司的5′-Full RACE Kit With TAP试剂盒反转录合成cDNA的第一链；

根据步骤(2)所得保守区序列设计CSRP2基因的5′特异性内侧和外侧引物；

以5′特异性外侧和5′通用外侧引物，以步骤(4)中得到的cDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；

以5′特异性内侧和5′通用内侧引物，以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增；

对第二轮PCR产物经克隆测序得到CSRP2基因cDNA序列的5′端序列；

(5)全长序列拼接及克隆测序验证：