[发明专利]利用幼嫩子房对烟草单个植株进行染色体制片的方法

权利要求书

1.利用幼嫩子房对烟草单个植株进行染色体制片的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取材：于花期内进行取材，取材时间为晴朗早上8:00-9:00之间，取材对象为幼小花蕾，以小孢子母细胞减数分裂期花蕾为佳，因不同材料花蕾大小存在差异；

(2)预处理及固定：用镊子将花蕾取下，去掉花柄后放入装有蒸馏水的小玻璃管中，轻轻振荡使花蕾浸入溶液中，快速置于4℃冰箱中放置18-24h(温度及时间可根据染色体形态自行调节)，吸出蒸馏水，加入卡洛氏固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定过夜；

(3)后续采用直接涂片、酶解后压片或涂片方法得烟草染色体制片；

任选地，压片后直接观察，获得良好中期分裂相，如需后续试验和长期保存，可采用常规方法揭片；直接涂片和酶解后涂片还包括染色步骤:用5％吉姆萨溶液进行染色,染色体时间控制在30秒至1分钟之间。

2.根据权利要求1所述的利用幼嫩子房对烟草单个植株进行染色体制片的方法，所述的直接涂片包括如下步骤：从玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科镊剥去花萼、花冠、雄蕊和柱头；用镊子夹取子房使其碎裂为小块，用镊尖夹取小块组织并滴加少量卡洛氏固定液于镊尖，直接在清洁、干燥的载玻片上涂抹，待材料涂布均匀后，滴加一滴固定液于涂布好材料的载玻片上，将固定液沿载玻片一端轻轻吹散开；于酒精灯火焰上微烤至固定液呈液滴状即可。

3.根据权利要求1所述的利用幼嫩子房对烟草单个植株进行染色体制片的方法，所述的酶解压片和涂片包括步骤(4)－(6)：

(4)酶解：从玻璃瓶中取出固定好的花蕾，用眼科镊剥去花萼、花冠、雄蕊和柱头，切除花托，并将子房分解为合适大小(边长约1-1.5毫米的方形块)后置于离心管中，加入蒸馏水清洗2次，后加入蒸馏水浸泡约20分钟，吸出蒸馏水，加入混合酶液(3％纤维素酶+0.03％果胶酶，不同厂家、批次的酶液可适当调节浓度)，酶和子房体积比为8-12:1，浸没材料，震荡使组织块在酶液中悬浮，于35℃恒温箱中放置,1.0-1.5小时(可根据材料调整)后取出；

(5)低渗处理：酶解后的材料从恒温箱中取出后，尖嘴吸管吸出酶液，加入蒸馏水，放置10-15分钟后吸出蒸馏水，加入卡洛氏固定液；

(6)压片：用镊子小心夹取材料，置于清洁干燥的载玻片中央，滴加一滴卡宝品红染色液，用镊子反复夹取材料使其分散于染液中，染色约1分钟后，夹取清洁、干燥盖玻片常规方法压片即可；

可选择地：

涂片：用镊子夹取材料，并于镊尖滴加卡洛氏固定液，在清洁的载玻片上快速涂抹，待材料涂布均匀后，滴加一滴固定液于载玻片上涂布好材料范围的中央，将固定液沿四周轻轻吹散开，酒精灯火焰上微烤至固定液呈液滴状即可。