[发明专利]适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法。

背景技术

豇豆是重要的蔬菜作物，在我国栽培历史悠久，除西藏等高寒地区外均有种植，以南方各省市栽培较多。豇豆营养价值很高，其籽粒富含蛋白质（占干物质总量25%）、维生素、叶酸及钾、镁、铁等矿质元素，并且还含有人体所必需的赖氨酸与色氨酸。 

传统豇豆栽培种的产量很低，对虫害及真菌病害高度易感是导致其产量低的一个主要因素。豇豆在田间生长期间及贮藏期间共有31种虫害和超过20种病害，仅虫害每年就可导致20%-60%的损失。对于病虫害的防治，人们主要采取使用化学药剂、加强农业管理措施和培育抗病虫害新品种等方式。但长期使用化学药剂，产生一系列的严重后果：病虫产生耐药性，药剂的大量使用对环境造成严重危害，威胁人类安全，“毒豇豆”事件触目惊心。农业防治耗费大量的人力物力却收效甚微。由于自然界缺乏有效的抗病虫种质资源及杂交不亲和性等，通过常规育种方法选育抗性品种较为困难。 

近年来，随着生物技术的飞速发展，尤其是植物基因工程技术的日趋成熟，为植物的品种改良提供了新的途径。自1983年第一个转基因植物问世以来，一些天然的抗虫基因（如Bt基因、蛋白酶抑制剂及凝集素等）被成功地转入一些作物中。提高豇豆产量、增强抗虫性最有效的途径就是通过基因工程将抗虫基因从其它材料中转入豇豆栽培品种，对其进行遗传改良。在众多转基因技术中，农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、转育周期短以及能转化较大片段等独特优点被广泛应用。而以农杆菌介导法获得转基因材料的前提是要建立一个高效稳定的再生受体系统。因此，建立豇豆高效再生体系可以为豇豆遗传转化体系的建立奠定基础。

    利用器官发生途径建立豇豆再生体系有多种，主要有子叶节、子叶、真叶、上胚轴、下胚轴、茎尖、子叶节薄细胞层、茎尖分生组织和胚尖等。其中，对子叶节再生能力研究比较多，如李晓梅利用子叶节作为外植体获得了较为理想的不定芽诱导率。然而，国内外对豇豆组织培养与植株再生研究还存在许多问题。豇豆再生能力存在基因依赖性，不同基因型之间再生能力存在显著差异，至今还没有建立一个适合不同基因型的豇豆再生体系。同时，主芽的生长一般来说更好，不定芽的干重对于再生体系的优良也至关重要。然而，目前对如何提高主芽的数量和提高不定芽的干重还鲜见报道。

因此，一种适用于多种基因型、可提高主芽数量并提高不定芽干重的豇豆再生体系的构建方法亟待开发。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法。构建方法包括以下步骤：

    1）前处理：将豇豆种子进行灭菌，然后放入含6-BA或TDZ的MSB₅培养基进行培养，培养时间为5天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为1-4mg/L，TDZ的浓度为0.001-0.1mg/L；

    2）不定芽的诱导：切取带一个子叶的子叶节，然后放入含6-BA 和 KT或含KT 和 IBA的MSB₅培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为0.8-1.2mg/L，KT的浓度为0.02-0.1mg/L，IBA的浓度为0.15-0.25mg/L；

    3）继代培养：将步骤2）所得物的不定芽的腋芽切下，弃掉，然后将剩余物接种于含6-BA 和 KT或含KT 和 IBA的MSB₅培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天；

    4）不定芽的伸长：将步骤3）所得物放入含6-BA和IBA的MSB₅培养基进行培养，培养时间为14天，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度为0.5mg/L，IBA的浓度为0.1-0.3mg/L；

    5）生根培养：将步骤4）所得物的不定芽切下，接种在含生根培养基的培养瓶上培养，培养时间为14天，培养温度为保持在23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，所述生根培养基为MS培养基添加30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH=5.8；