[发明专利]高纯L‑α‑氨基酸的生物合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型生物法转化合成L-α-氨基酸及纯化浓缩结晶得到高纯度L-α-氨基酸的方法，属于生物合成领域。

背景技术

氨基酸是组成蛋白质的基本物质，是人体生命活动的必需，它在体内担负着合成肌肉、皮肤、脏器、酶、免疫抗体所必需的成分。一般而言氨基酸分为D型和L型，人体中只有L型氨基酸才参与代谢，具有生理活性。

L-正缬氨酸是合成培哚普利、ACE-抑制剂—抗高血压类药物的关键中间体。L-正缬氨酸可以通过拆分外消旋的DL-正缬氨酸获得，也可以通过直接合成获得，相关的报道较少。日本专利JP7553587采用发酵法制取，产量约为3.79g/L，远低于一般发酵生产氨基酸的产量，难以满足工业化的生产需求。中国专利CN1651400，公开了以正丁醛和丙酮氰醇为原料合成L-正缬氨酸的技术，该方法采用了剧毒的丙酮氰醇作为反应原料，且丙酮氰醇不易得，价格偏高，有其局限性。中国专利CN101007772对其进行了一定改进，采用氰化钠替代丙酮氰醇为反应原料，降低了原料成本，但存在同样缺点是氰化钠也是剧毒的化工原料，同时反应步骤多，总收率不高。陈新志在中国专利CN1962613中，公开了以正戊酸为起始原料经酰氯化、溴化、氨化、拆分、重结晶、水解合成L-正缬氨酸的技术，同时在中国专利CN101007774中公开了相同工艺路线合成D-正缬氨酸的技术，上述两专利避免了使用剧毒原料，降低了生产成本，但仍然存在反应步骤多，总收率不高等问题。中国专利CN101508654A公开了一种DL-正缬氨酸的合成方法，以正戊酸为主要起始原料，依次经过溴代、氨解、离子交换分离回收得到DL-正缬氨酸，再进一步经化学拆分或酶法拆分得到手性正缬氨酸。该专利提高了合成段的收率，但需要进一步拆分才能得到L-正缬氨酸，反应步骤多，总收率不高。

L-亮氨酸是合成新型静脉抗肿瘤药物卡非佐米的关键中间体。L-亮氨酸大部分通过发酵法提取获得，也可以直接通过化学法合成。国内外相关专利和论文报告，L-亮氨酸提取方法主要有沉淀法、离子交换法提取、乳状液膜法，其中离子交换法提取分离效果和效率较高，过程主要包括：离心处理发酵液，加入晶种后进行多次重结晶，然后加入活性炭脱色，阳离子交换树脂层析后浓缩抽滤粗结晶再加入95％的乙醇重结晶过滤干燥得到成品。整个过程繁琐复杂，能耗高，收率只有71.28％，同时对设备的要求严苛，不便于工业化生产。

发明内容

针对现有技术中L-亮氨酸的合成方法存在过程繁琐、反应条件苛刻、收率低、分离提纯困难等一系列缺陷，本发明的目的是在于提供一种基于生物酶为催化剂，以醛类化合物和甘氨酸原料在温和条件条件下高产率合成高纯度L-α-氨基酸的方法，该方法以水相为反应体系，环保、廉价，设备要求低、酶可以反复使用，成本低，满足工业化生产。

本发明提供了一种高纯L-α-氨基酸的生物合成方法，该方法是在反应液中，醛类化合物和甘氨酸原料在L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶的催化作用下，于pH为6.0～8.0，温度为20～40℃的条件下进行酶催化反应I，反应产物通过层析分离后，得到2-酮酸溶液；将所得2-酮酸溶液调节pH到7.5～8.5后，加入由亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶组成的辅酶，在20～40℃温度下进行酶催化反应II，反应产物依次经过电渗析脱盐、活性炭脱色、浓缩结晶、真空干燥处理，得到L-α-氨基酸晶体；所述的L-苏氨酸醛缩酶和L-苏氨酸脱氨酶复合酶中L-苏氨酸醛缩酶与L-苏氨酸脱氨酶的总活力比为3～4:2～3；所述的辅酶中亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶的总活力比为1:1.5～2.5；

所述的醛类化合物具有式1结构：

所述的2-酮酸具有式2结构：

所述的L-α-氨基酸具有式3结构：

其中，

R为C₁～C₄的脂肪烃基。

本发明的高纯L-α-氨基酸的生物合成方法还包括以下优选方案：

优选的方案中R为C₁～C₄的直链烷烃基或直链取代烷烃基、烯烃基或取代烯烃基、炔基或取代炔基中一种；最优选为C₁～C₄的直链烷烃基。

优选的方案中L-苏氨酸醛缩酶在反应液中的加入量相对于醛类化合物为30000U/mol～80000U/mol；最优选为30000U/mol～50000U/mol。