[发明专利]检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测蔬菜中吡虫啉的酶联免疫试剂盒。

背景技术

吡虫啉（imidacloprid），化学名称1-（6-氯-3-吡啶基甲基）-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺。吡虫啉具有广谱杀虫活性，对飞虱、蚜虫、叶蝉等刺吸式口器害虫有特效，对其他种类的害虫也有良好的防治效果。吡虫啉是蔬菜种植过程中常用的农药，对吡虫啉残留检测成为国家对蔬菜类植物中农药残留监控的必要手段。日本规定吡虫啉在蔬菜中的最高残留限量（MRL）为0.5mg/kg。

酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、吡虫啉标准品、吡虫啉抗体工作液、吡虫啉酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、吡虫啉标准品的制备、吡虫啉抗体工作液的制备、吡虫啉酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由吡虫啉抗原包被制备，具体步骤是将吡虫啉半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将吡虫啉包被抗原稀释成1：40000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

吡虫啉标准品浓度分别为0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。

所述吡虫啉抗体工作液是采用吡虫啉人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。

所述吡虫啉酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.1mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有吡虫啉抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中，加入吡虫啉酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入吡虫啉抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；

(4)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(5)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；

(6)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；

(7)以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中吡虫啉的含量。

其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：

a、取20g样品，经组织捣碎匀浆后置于250mL三角瓶内；