[发明专利]一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光PCR的检测试剂盒及引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体检测用引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体均是细胞内寄生菌。嗜吞噬细胞无形体侵染人末梢血中性粒细胞引起人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)，以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现。查菲埃里克体侵染人单核巨噬细胞，引起人单核细胞埃立克体病((human monocytic ehrlichiosis，HME)，与人粒细胞无形体病临床症状十分相似，以发热、淋巴结肿大和出现异型淋巴细胞为主要临床表现。HGA和HME都是自然疫源性人畜共患病，呈世界性分布，主要经蜱叮咬传播。

立克次体病临床表现一般缺乏特异性，如表现为不明原因的高热、头痛、全身酸痛、食欲不振等，常常误诊为其它传染病，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于立克次体感染的早期诊断。由于大多数立克次体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细胞培养等对立克次体病原进行分离。立克次体病原分离操作复杂，费时费力且成功率很低。因此立克次体的传统检测方法已逐渐被酶联免疫吸附技术、PCR技术、芯片技术等现代检测方法所代替。如今，研究的趋势更是进一步转向了在一个检测平台上同时检测多种致病菌，以此缩短检测周期、减少检测成本。因此，能同时快速有效检测多种病原微生物的高通量检测技术已成为临床疾病检测，国境口岸卫生检疫，公共安全等领域研究的热点。

本研究着重研究影响检测鼠源性立克次体病多重荧光PCR技术方法的关键因素，提出解决方案，促使形成技术升级的同时，形成产业化。

发明内容

本发明的目的是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的核苷酸序列，包括引物和探针。

本发明的另一目的是提供快速、准确、使用方便的检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的引物和探针，具体如下：

通过序列比较，根据嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum，AP)主要外膜蛋白(msp2)基因的序列(GenBank：KC954740)，在其保守区169-245位置设计一对引物及一条探针：

1)AP正义引物(AP-F)5'ATGGAAGGTAGTGTTGGTTATGGTATT 3'(SEQ ID NO：1)；

2)AP反义引物(AP-R)5'TTGGTCTTGAAGCGCTCGTA 3'(SEQ ID NO：2)；

3)AP探针(AP-probe)5'(JOE)TGGTGCCAGGGTTGAGCTTGAGATTG(TAMRA)3'(SEQ ID NO：3)，该探针的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；

扩增目的片段为77bp。

通过序列比较，根据查菲埃里克体(Ehrlichia chaffeensis，EC)16SrRNA基因的序列(GenBank：KJ942243)，在其保守区17-97位置设计一对引物及一条探针：

4)EC正义引物(EC-F)5’GCGGCAAGCCTAACACATG 3’(SEQ ID NO：4)；

5)EC反义引物(EC-R)5’CCCGTCTGCCACTAACAATTATT 3’(SEQ ID NO：5)；

6)EC探针(EC-probe)

5’(FAM)AGTCGAACGGACAATTGCTTATAACCTTTTGGT(TAMRA)3’(SEQ ID NO：6)，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；

扩增目的基因大小为80bp。

本发明还提供了一种嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒，由以下组分组成：

1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的DNA提取试剂盒或按照常规方法来提取DNA，所述商业化的DNA提取试剂盒例如TIANamp Genomic DNA Kit,cat.no DP304；