[发明专利]枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

说明书

技术领域

本发明涉及枸杞多糖四种指纹图谱的建立方法，分别是枸杞多糖UV、HPSEC、IR、PCD-HPLC指纹图谱，本发明还涉及由此方法所得到的枸杞多糖标准指纹图谱。属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。

背景技术

枸杞子为茄科植物枸杞的成熟果实，别名西枸杞、白刺、山枸杞、白疙针，简称枸杞，现代药理学研究表明：枸杞具有补肾益精，养肝明目，补血安神，生津止渴，润肺止咳之功效，临床主要用于治疗肝肾阴亏、腰膝酸软、头晕目眩、目昏多泪和虚劳咳嗽等疾病。枸杞多糖是其发挥药理学作用的主要物质基础，也是被研究最多的化学成分之一，具有免疫调节，抗氧化，神经保护，降血糖，抗肿瘤等作用。近年已将枸杞和枸杞多糖开发成为多种保健功能食品，如枸杞汁、枸杞胶囊、枸杞咀嚼片、枸杞多糖口服液、枸杞果酒等。

多糖是一类由广泛存在于自然界的生物体产生的独特的生物高分子，是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子，具有多种特殊的且在大多数情况下相当复杂的化学结构，主要表现在：组成多糖的单糖种类、连接位点多，分支结构、糖基的排列顺序、糖苷键构型非常复杂，例如4种不同的单糖可形成35560种四糖，而单一的化学分析法、仪器分析法难以识别一般多糖的多方面的结构特征。研究表明：枸杞多糖是一种蛋白结合杂多糖，结构复杂，由2-9种不同的单糖组成，相对分子量范围为8×10⁴-2×10⁶Da，糖链中含有β-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃半乳糖等单糖，而药典中仅采用含量测定法，并不能表征和鉴别枸杞样品中多糖的实际质量优劣，急需建立一种快速可靠的指纹分析模型来识别和表征枸杞多糖。指纹图谱分析法已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一，可识别复杂的天然产物，近年来，该法在分析中药材中小分子化合物的基础上，也被用于少数多糖的分析，如：灵芝孢子粉多糖和铁皮石斛多糖，因此，可将指纹图谱技术用于枸杞多糖的分析。

目前关于枸杞指纹图谱相关的专利及文章包括：枸杞中甲醇粗提物、乙醇乙腈粗提物、黄酮类化合物、甜菜碱和类胡萝卜素等小分子化合物的指纹图谱，而有关其主要功效成分的大分子枸杞多糖的指纹图谱的构建尚未见报道。然而，枸杞多糖作为一种结构复杂的天然生物高分子，其科学全面的检测方法和质量标准尚不完善，以至于枸杞、枸杞多糖及其相关产品质量参差不齐、难以控制和鉴别。为此，本发明针对枸杞的主要功效成分多糖类物质，分别采用预处理-热水浸提-UV全波长扫描法、预处理-热水浸提-高效分子排阻色谱法、预处理-热水浸提-红外光谱检测法和预处理-热水浸提-完全酸水解-PMP柱前衍生反相HPLC法，对不同产地枸杞样品中的多糖的结构特征指标进行分析表征和比较，确定共有特征峰，建立枸杞多糖的标准指纹图谱。本发明可为我国枸杞和枸杞多糖的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科学依据与参考，从而促进我国枸杞类产品的质量提高和稳定，更好地规范枸杞市场，维护消费者权益，造福于国人的身体健康。

发明内容

本发明的目的是提供枸杞多糖的四种指纹图谱的构建方法，可将枸杞多糖多元指纹图谱作为枸杞类、枸杞多糖类产品的质量控制和真伪鉴别的主要指标之一。同时，本发明还提供了枸杞多糖的四种标准指纹图谱。

本发明的技术方案：枸杞多糖多元指纹图谱的建立方法包括下列步骤：

1、枸杞的预处理

准确称取枸杞子120g，均匀平铺于瓷盘中，60℃烘6h使其完全干燥，将枸杞子干品用粉碎机粉碎，计重M₁g。将M₁g枸杞粉置于1000mL烧瓶中，加入3倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂后置于1000mL烧瓶中，加入2.25倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂，烘干，计重M₂g。将M₂g乙醇处理后样品置于索氏提取器中，加入6倍体积氯仿甲醇(氯仿∶甲醇＝2∶1)混合溶液，70℃回流脱脂4h，抽干弃去溶剂，干燥，得脱脂后枸杞粗粉M₃g。

2、枸杞多糖的提取

将M₃g枸杞粗粉置于烧杯中，按料液比1∶15加入蒸馏水，80℃提取3次，每次2h，将水提液合并，过滤。减压蒸发浓缩至水提液总体积的1/5，4000rpm离心5min除去杂质，加入4倍体积工业乙醇醇沉10h。4000rpm离心10min得到沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干燥，得枸杞多糖粗品cLBP。

3、枸杞多糖UV标准指纹图谱的确定