[发明专利]检测新霉素的时间分辨荧光免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测新霉素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。

背景技术

新霉素是一种广谱抗生素，常用于动物各种传染病的治疗，对于多种病原菌有较强的抑制作用，对革兰氏阳性和阴性菌皆有效。新霉素存在严重的副作用，具有肾毒性和内耳毒性，它对内耳的伤害，往往是不可逆转的，因此动物食品中的新霉素残留对人类的健康构成巨大威胁。近年来已在家禽养殖中禁止使用。但在实际养殖中仍存在兽药乱用、滥用的现象。

新霉素残留分析一般使用气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）及气相色谱质谱联用技术（GC/MS），这些方法灵敏、准确，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器，样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高，而且需专业人员操作，很难满足对样品进行现场、批量、快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于兽药残留现场监控的分析方法具有重要的现实意义。

而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对新霉素检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种动物组织中新霉素残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种快速简便地检测蔬菜水果中新霉素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测蔬菜水果中新霉素残留量。

本发明目的之一是这样实现的：检测新霉素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、新霉素标准品溶液、抗新霉素的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。

本发明目的之二是这样实现的：检测新霉素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于：

(1)免疫原的制备：将半抗原新霉素与牛血清白蛋白（BSA）偶联，得到免疫原（新霉素-BSA）；

(2)包被原的制备：将半抗原新霉素与卵血清白蛋白（OVA）偶联，得到包被原（新霉素-OVA）；

(3)单克隆抗体的制备：

a.用步骤(1)的免疫原（新霉素-BSA）免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗新霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

b.以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗新霉素的单克隆抗体IgG；

c.用步骤(2)的包被原包被96孔包被板；

(4)样品的前处理及检测：

取包被有包被原（新霉素-OVA）的多孔包被板，加入50μL的新霉素到各自的微孔中，加50μL以缓冲液稀释的抗新霉素抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的100μLEu³⁺-兔抗鼠抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗6次，加200μL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的新霉素含量。

上述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作为固相载体。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测新霉素。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面：第一，特异性单克隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗新霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗新霉素的单克隆抗体IgG。第二，Eu³⁺标记抗体的制备。

本发明测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有新霉素-OVA的多孔包被板，加入测试样品到各自的微孔中，再加入抗新霉素抗体，振荡反应，游离的新霉素与微孔板上的新霉素-OVA竞争抗新霉素抗体，洗涤液洗涤，没有连接的新霉素抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu³⁺-兔抗鼠抗体,进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu³⁺-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外灯的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中新霉素的量。

本发明检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

具体实施方式