[发明专利]一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种定量检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心法，属于免疫分析领域。 

背景技术

丁香假单胞杆菌斑点致病变种(Pseudomonas syringae pv. Maculicola)是世界上重要的十字花科蔬菜病菌，主要引起十字花科细菌性黑斑病。该病菌在分类上属于原核生物细菌界、变形杆菌门、假单胞菌科。该菌最适培养温度在25 - 27℃，主要宿主有白菜、萝卜、花椰菜等十字花科蔬菜。 

加强检疫工作，预防带菌种子在非疫区传播是控制该病菌的重要措施。国内外报道主要在致病机理、分离菌株分型等方面，目前还未见有免疫检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的报道。 

发明内容

(一)要解决的技术问题 

  本发明的目的在于建立一种丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心ELISA检测方法，用于特异、灵敏、批量、快速检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌。

(二)技术方案 

实现上述目的，本发明首先应用灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过免疫、细胞融合、筛选后得到6株产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。6株抗体分别标记辣根过氧化物酶（HRP）并以丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌为目标物进行两两配对。以抗体1D3和6C6分别作为包被抗体和酶标抗体，建立了丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心ELISA分析方法，LO D为1.5 *10 ⁵cfu/mL。

一种检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法，是基于单克隆抗体的ELISA法，包被抗体为1D3即CGMCC No.9312单克隆细胞株Q号，检测抗体为6C6即CGMCC No.9313单克隆细胞株R号； 

（1）丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌单克隆抗体的制备：

以丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌灭活菌体（NCPPB1820，菌株来自湖南省进出口检验检疫局）做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠；经杂交瘤技术融合、筛选得到； 

（2）单克隆抗体的配对筛选：

将纯化后的6株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体2μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度1×10⁸cfu/mL；标品稀释液0.01M、pH7.2的PBS；酶标抗体稀释500倍使用；在此条件下，实验成功得到了6对P/N值>5的配对；

（3）夹心法的建立：选择检测限稳定、灵敏的配对，即以1D3即CGMCC No.9312单克隆细胞株Q号为包被抗体，6C6即CGMCC No.9313单克隆细胞株R号作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

包被抗体1D3浓度：5μg/mL；

包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液；

标品稀释液：0.01M、pH7.2 PBS+0.2% Tween；

酶标抗体6C6-HRP浓度：2μg/mL；

反应时间：包被抗体：封闭37℃，反应2h；标准品：37℃，反应1h；酶标抗体37℃，反应1h；显色时间10min。

所述检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的双抗体夹心酶联免疫法的LOD为1.5×10⁵ cfu/mL。 

本发明方法的检测分析原理是： 

酶标板上包被了适量的捕获抗体1D3；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品和对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体6C6-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品有足够的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌，那么丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌被捕获抗体捕获并与酶标抗体6C6-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值（P/N≥2.1），并被判定为阳性；如果样品无丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌或浓度太低（P/N≤2.1）那么无丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

(三)有益效果 

本发明提供的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌双抗体夹心检测方法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，能同时检测大量样品，适合丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌的检测要求，具有推广和应用价值。