[发明专利]一种治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，具体包括以下组分：

a、混匀于生理盐水的浓度为1×10⁷～1×10⁸个/ml骨髓多潜能干细胞悬液1份；

b、混匀于生理盐水的浓度为1×10⁷～1×10⁸个/ml骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞悬液1份；

c、混匀于生理盐水的浓度为1×10⁷～1×10⁸个/ml脂肪干细胞悬液1份。

2.根据权利要求1所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，所述的生理盐水中添加了是含有寡糖、白蛋白、胆固醇、氯化钠、丙二醇和碳酸氢铵，各成分浓度为50g/L、50g/L、0.3g/L、9g/L、5%、20g/L。

3.一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）生理盐水的制备：首先配制生理盐水，然后添加寡糖、白蛋白、胆固醇、氯化钠、丙二醇和碳酸氢铵，使其浓度分别是50g/L、50g/L、0.3g/L、9g/L、5%、20g/L；

步骤2）骨髓多潜能干细胞悬液的制备：包括骨髓多潜能干细胞的分离提取，收集骨髓多潜能干细胞与步骤1）制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1×10⁷～1×10⁸个/ml骨髓多潜能干细胞悬液； 

步骤3）骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞悬液的制备：包括，收集步骤2）制备的骨髓多潜能干细胞，进行骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞的诱导分化，收集骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞与步骤1）制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1×10⁷～1×10⁸个/ml骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞悬液； 

步骤4）脂肪干细胞悬液的制备：包括脂肪干细胞的分离提取，收集脂肪干细胞与步骤1）制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1×10⁷～1×10⁸个/ml脂肪干细胞悬液；

步骤5）将上述步骤2）、步骤3）和步骤4）干细胞悬液按照1:1:1进行混匀即制备成一种治疗糖尿病的干细胞制剂。

4.根据权利要求3所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）中骨髓多潜能干细胞的分离提取包括以下步骤：采集健康髂骨骨髓，以肝素抗凝；

加入10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，混匀，1500r/min，离心5min，去上清，然后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液制成细胞悬液，进行计数板计数，以1×10⁶/ml的细胞数量接种于含青霉素、链霉素各1万U/100ml、含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，24小时后换液，以后每两天换液一次，细胞融合达80%～90%可以传代，收集第三至五代骨髓多潜能干细胞备用。

5.根据权利要求3所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤3）中骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞的诱导分化包括以下步骤：

第一步，将培养得到的第三至五代骨髓多潜能干细胞悬液，细胞浓度为1×10⁶/皿接种于transwell上层，贴壁24小时后，更换成诱导培养体系A诱导培养7天，采用10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，其中含有10μmol/ml的尼克酰胺、10ng/ml的表皮细胞生长因子和10ng/ml的碱性成纤维生长因子，然后更换成诱导培养体系B诱导培养7天，其中含有10ng/ml的Exendin-4、10ng/ml的β细胞调节素,10ng/mL肝细胞生长因子和10ng/mL活化素A；

第二步，将培养得到的第三至五代骨髓多潜能干细胞悬液，细胞浓度为1×10⁶/皿接种于transwell下层，使其与上层诱导的胰岛样细胞共培养7天，采用10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，每两天换液一次；

第三步，用磷酸盐缓冲溶液洗涤后收集下层共培养后的骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞。

6.根据权利要求3所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤4）中脂肪干细胞的分离提取包括以下步骤：无菌条件下获得人体脂肪组织，剪碎后用PBS溶液清洗去除血细胞；采用消化液（含有0.1%的                                                型胶原酶和2.5%胰酶，以1:1比例混合配制而成）消化脂肪组织，反复剪碎至糊状后170r/min 震荡消化30 分钟；吸取下层单个细胞的液体，移入完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）中终止消化，然后1500r/min离心5分钟，去上清后重悬于完全培养基中，放入37℃，5% CO₂培养箱中培养；

第一次换液在培养12~24小时后，观察细胞贴壁后可进行第一次换液，此后每两天换液一次，细胞融合达80%～90%可以传代，收集第三至五代脂肪干细胞备用。