[发明专利]一种蟾酥靶向脂质体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及靶向脂质体，尤其涉及碳酸酐酶CA9抗体修饰的蟾酥脂质体及其构建方法及其在抗肿瘤中的应用。

背景技术

蟾酥(Bufotoxin)为蟾蜍(Toad，俗名癞蛤蟆)的耳后腺和皮肤腺体的干燥分泌物，能强心、兴奋呼吸中枢和横纹肌，具有升高血压、镇痛、平喘、镇咳、抗炎和抗肿瘤作用，是重要的传统中药材。蟾酥多入丸、散，著名中成药六神丸、喉症丸、梅花点舌丹都含有蟾酥这味药，除此之外，国家食品药品监督管理局还批准上市的蟾酥药品有蟾酥锭、蟾酥注射液、蟾酥镇痛膏、复方蟾酥丸、复方蟾酥膏、蟾酥镇痛巴布膏。但蟾酥属2类毒性中药，最高用量为0.015-0.03g，所含的蟾酥毒素通过兴奋迷走神经中枢或末梢，直接作用于心肌，出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛、体力不支、头晕、心悸、胸闷、口唇及四肢麻木等症状，严重者会发生口唇青紫、抽搐，甚至出现循环、呼吸系统衰竭而导致死亡。这些毒副作用大大增加了蟾酥临床使用的风险，所以临床合理用药、制剂工艺的改进，对提高药物安全性显得尤为重要。

1993年，有学者在与人乳腺癌细胞联合培养的宫颈癌的HeLa细胞系中发现了MN蛋白。随后的研究发现，该蛋白结构与碳酸酐酶(CA)相似，并被确认为是一种碳酸酐酶的异构酶，遂被命名为CA9。它是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由459个氨基酸组成，分布在细胞膜和细胞核，相对分子质量分别为58kD、54kD。碳酸酐酶CA9参与调节细胞内外的酸碱度，在肿瘤细胞的生长和存活过程中发挥重要作用。在一般情况下，CA9仅表达于极少的正常组织，如胃、胆管、胰腺、小肠和输精管上皮，而且表达量极少，而在结肠癌、膀胱癌、肾癌、子宫颈癌、脑胶质瘤、胃癌中可以高表达碳酸酐酶CA9，现有技术中大部分被用于肿瘤的诊断，虽然现有技术中有描述可以将CA9用于治疗，但是并没有给出具体怎样利用CA9进行治疗。

发明内容

1、本发明的目的。

本发明为了解决现有技术中既能有有效利用蟾酥的药性，同时减少蟾酥药物的巨大毒性对人体产生的毒副作用，并且能够有针对性的对癌细胞进行抑制，减少对人体正常细胞的伤害和患者治疗痛苦，提高治疗效果，从而提出的一种蟾酥靶向脂质体及其制备方法和应用。

2、本发明所采用的技术方案。

（一）蟾酥靶向脂质体

蟾酥靶向脂质体，括碳酸酐酶CA9抗体、蟾酥和脂质体，蟾酥包裹在脂质体内，并与CA9连接。更具体地，与CA9连接方式为将CA9抗体连接到脂质体聚乙二醇链末端。

在进一步具体的实施例中，蟾酥靶向脂质体的膜材料选自以下材料：a、天然大豆卵磷脂或合成的磷脂；b、胆固醇；c、聚乙二醇-磷脂复合物和d、碳酸酐酶CA9抗体-聚乙二醇-磷脂复合物的组合物。所述的材料c中聚乙二醇-磷脂复合物中聚乙二醇的分子量为1000-5000g/mol；所述的材料d中碳酸酐酶CA9抗体-聚乙二醇-磷脂复合物中聚乙二醇的分子量为1000-8000g/mol。

在进一步具体的实施例中，脂质体膜材料的摩尔比为a∶b=4:1-1:1，a:c=1000:1-1000:100，a:d=1000:1-1000:100。

在进一步具体的实施例中，蟾酥与所述脂质组分的质量比是0.1%至50%。

在进一步具体的实施例中，脂质体粒径范围为20-200nm。

在进一步具体的实施例中，所述的聚乙二醇-磷脂复合物或碳酸酐酶CA9抗体-聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。

（二）蟾酥靶向脂质体的制备方法

本发明的蟾酥靶向脂质体的制备方法，按照如下步骤进行：

1）制备蟾酥脂质体

使用挤出机经过聚碳酸酯过滤器用数个循环挤出，控制粒径在20-200nm之内。

2）制备蟾酥靶向脂质体

添加蟾酥脂质体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳酸酐酶CA9抗体，置于4℃条件下反应4-20小时；

3）纯化

使用透析袋透析，除去未包封的蟾酥、蟾酥脂质体、未连接的碳酸酐酶CA9抗体、EDC·HCl、S-NHS；

4）干燥

对透析得到的蟾酥靶向脂质体冷冻干燥，得到粉末状样品，以便于保存。