[发明专利]针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，属于生物技术领域。标准的杂交瘤技术，以一株H3N2犬流感病毒株JS/10为试验毒株，最终通过血凝抑制、中和试验以及Westernblotting筛选得到针对保守蛋白HA2的单克隆抗体D7，为H3N2犬流感病毒感染的治疗提供重要的免疫制剂。

背景技术

杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇(PEG)为细胞融合剂，使免疫小鼠的脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养(克隆化)，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。而具有中和活性的单克隆抗体，可通过阻止病毒吸附或病毒与宿主细胞间的融合，发挥抗病毒感染作用。有研究表明，具有中和活性的单克隆抗体能有效预防流感病毒感染[SkehelJJ,Wiley DC.Receptor binding and membrane fusion in virus entry:the influenza hemagglutinin.Annu Rev Biochem2000,69:531-569.]。

流感病毒属于正黏病毒科的一种单链负股RNA病毒，分为A、B、C三个型，其中A型流感病毒是一种具有高度传染性的病原体，可感染禽类和多种哺乳动物宿主。犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)是一种新发现的能在犬中引起流行的高度接触性呼吸道传染病。犬流感病毒不仅对犬类的生存和健康带来严重的危害，同时也给人类健康带来巨大的风险。一方面，流感病毒通过在犬等哺乳动物体内的适应，可能会更容易获得感染人的能力，犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，犬有可能会作为中间宿主将流感病毒传播给人类；另一方面，研究表明多种亚型的流感病毒能够感染犬类，当犬类感染两种以上的流感病毒时，流感病毒可能会在犬体内经过基因重配形成能够感染人的重组流感病毒。有学者推测，犬可能成为下一个引起大流行的新型流感病毒“混合器”。因此控制犬流感病毒的传播和流行非常必要，在公共卫生上具有重要意义。

自从2004年马源H3N8亚型犬流感在美国爆发，引起人们极大的关注，改变了此前人们认为犬对流感病毒具有抵抗力的观点。2007年，H3N2亚型犬流感病毒在韩国首次报道，随后，在中国陆续分离到此亚型的犬流感病毒。目前H3N2亚型犬流感病毒已经成为中国犬群中流行的主要亚型[Zeng XJ,Lin Y,Zhao YB et al,Experimental infection of dogs with H3N2canine influenza virus from China.Epidemiol Infect2013,141:2595-2603.]。

疫苗接种是预防和控制流感病毒感染的主要措施，目前对CIV疫苗研究已取得一些进展。2009年，美国农业部门(USDA)批准的H3N8亚型CIV疫苗上市，有效减少了病毒的传播[Deshpande MS,Jirjis FF,Tubbs AL,et al.Evaluation of the efficacy of a canine influenza virus(H3N8)vaccine in dogs following experimental challenge.Vet Ther2009,10:103-112.]。2012年，韩国针对H3N2CIV的疫苗也已授权[Cho YS,Ha GW,Oh JS,et al.Canine influenza virus and vaccine therefore.United States Patent2012,Patent No:US8,246,962B2.]。尽管如此，疫苗接种仍有一定的局限性，在幼年、老年及免疫力低下的犬群中疫苗接种有相当大的风险。而有中和活性的单克隆抗体，通过抑制病毒对宿主细胞的吸附或复制过程而中和病毒；还可能参与体内其他的抗病毒保护机制如免疫调理作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)作用等，从而激活患犬体内的细胞免疫，达到清除病毒的作用。目前为止，还没有针对犬流感病毒制备单克隆抗体进行治疗的报道。