[发明专利]一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重链可变区和compα螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白；

所述gp96抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第3位至第116位所示；

所述compα螺旋的氨基酸序列如SEQ ID No.2中自N端起第123位至第170位所示；

所述融合蛋白为由含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体在所述原核细胞中自动组装形成的多聚体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述gp96抗体的重链可变区和所述compα螺旋分别在所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体中的N端和C端。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合表达的方法是将5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段导入所述原核细胞中。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述gp96抗体的重链可变区编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第7位至第348位核苷酸所示；

所述compα螺旋编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第367位至第510位核苷酸所示。

5.根据权利要求3任一所述的方法，其特征在于：所述5’-3’方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和compα螺旋编码基因的DNA片段如SEQ ID No.1所示；

所述含有gp96抗体的重链可变区和compα螺旋的抗体单体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述DNA片段是通过重组表达载体导入所述原核细胞中的，所述重组表达载体具体是将SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pET28a(+)质粒EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点间得到的；

所述原核细胞为大肠杆菌。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述表达之后还包括细胞裂解、离心收集沉淀并将沉淀进行层析分离的步骤。

7.根据权利要求6任一所述的方法，其特征在于：所述层析分离包括镍离子亲和层析和分子筛层析；

所述镍离子亲和层析的步骤如下：

a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱；

b、将所述离心收集的沉淀溶解后得到的上清加入镍离子柱；

c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去非特异性结合的蛋白；

d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；

所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na₂HPO₄、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na₂HPO₄在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述60mM咪唑 溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为60mM，所述60mM咪唑溶液的pH为7.7；

e、用500mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，记作蛋白液1；

所述500mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na₂HPO₄、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na₂HPO₄在所述500mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述500mM咪唑溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述500mM咪唑溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述500mM咪唑溶液中的浓度为500mM，所述500mM咪唑溶液的pH为7.7；

所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na₂HPO₄、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na₂HPO₄在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M,所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述8M的尿素溶液的pH为7.7；

所述分子筛层析具体为Superdex 200分子筛层析；

所述Superdex 200分子筛层析的步骤如下：

a、用pH7-7.4的PBS溶液预平衡Superdex 200分子筛至少2个柱体积；

b、将蛋白液1加入分子筛；

c、用pH7-7.4的PBS溶液冲洗分子筛，收集洗脱液，在280nm处测定洗脱液的吸收值，收集分子量为440kD-669kD的洗脱峰，即为所述人热休克蛋白gp96的scFv抗体。