[发明专利]检测邻苯二甲酸二丁酯的试剂盒制备及检测方法

权利要求书

1.一种检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、邻苯二甲酸二丁酯标准品、邻苯二甲酸二丁酯抗体工作液、邻苯二甲酸二丁酯酶标二抗工作液、底物液A、底物液8、终止液和浓缩洗涤液。

2.检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、邻苯二甲酸二丁酯标准品的制作、邻苯二甲酸二丁酯单克降抗体及其工作液的制备、邻苯二甲酸二丁酯酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

3.根据权利要求2所述的检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的邻苯二甲酸二丁酯包被抗原是将邻苯二甲酸二丁酯半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为鸡卵清白白蛋白(OVA),取0.2mol/LNa₂C038mL，与0.2mol/LNaHC0317mL混合，再加75mL双蒸水，调pH值到9．6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将邻苯二甲酸二丁酯抗原稀释成l：4000比例，100uL/孔，37℃放置2h，取出酶标板拍掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300uL/孔，洗板2次，30s/次；然后加入10％牛血清白蛋白(BSA)封闭，180uL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)

晾干，抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

4.根据权利要求2所述的检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的邻苯二甲酸二丁酯标准品浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/ml、2.5ng/mL。

5.根据权利要求2所述的检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的邻苯二甲酸二丁酯蛋白质偶联物单克隆抗体是采用邻苯二甲酸二丁酯人工抗原免疫鼠所得，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成l：16000。

6.根据权利要求2所述的检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的邻苯二甲酸二丁酯酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1：33000比例；所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是l0倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0．01mol/L的PBST，pH值范围为7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测邻苯二甲酸二丁酯的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20～25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有邻苯二甲酸二丁酯抗原的酶标板，加标准品/样本50uL/孔到对应的微孔中；

(4)加入邻苯二甲酸二丁酯抗体工作液，50uL/孔,反应30min,再加入邻苯二甲酸二丁酯酶标二抗工作液，50uL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；

(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260uL/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡用未使用过的枪头戳破)；

(6)加入底物液A50uL/孔，底物液B50uL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min；

(7)加入终止液50uL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5min内读完数据)；

(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

称取奶粉50g放入具塞三角瓶中，加入150mL的正己烷，充分混匀；20℃水浴超声萃取1h，浸泡过夜。

9.提取液经无水硫酸钠过滤，氮吹浓缩至lmL；将SimonAldrichTMC8(3mL/200mg)固相萃取柱依次用5mL二氯甲烷、5mL甲醇、5mL纯净水淋洗进行活化，将待净化液过柱，流速小于1mL/min；E.以5倍体积洗脱缓冲液洗脱，收集待用。