[发明专利]检测洛克沙胂的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测洛克沙胂的酶联免疫试剂盒，其适用于饲料(原料、配合料、浓缩料)中洛克沙胂测定。

技术背景

有机胂制剂作为饲料添加剂，在世界备广泛应用于禽类促生长，在禽畜养殖中取得了相当的经济效益。目前我国及美国药品与食品管理局（FDA）等批准使用的有机胂制剂主要有洛克沙胂和阿散酸。以洛克沙胂使用较多。它们都具有广谱杀菌作用，对肠道寄生虫也有抑制和杀灭作用．还可使毛细血管通透性增强，主要作用于肠道，改善肠道的理化环境。具有类似抗生素的作用．对猪能促进生长。提高饲料利用率，使其皮肤红润，毛发光亮，防止腹泻；对鸡可促进生长、提高饲料报酬和产蛋率，增进卵黄色素沉着，防止球虫病和大脑杆菌病的产生。因此，对动物有一定的促生长和改善产品外观作用。

含砷坷料添加斜的使用，促进了畜牧业的发屐，取得了较好的社会经济教益。但有机胂饲料添加剂在动物体内吸收较少，大多数随着禽粪便直接排出但有机胂饲料添加剂在动物体内吸收较少，大多数随着禽粪便直接排出．且前我国大多数的畜禽粪便未经过无害化处理。大量含胂的畜排泄物进入环境，对环境造戊了污染。在生态环境日趋恶化的今天，人们越来越关注含胂饲料添加剂随畜禽排泄物进入环境后在环境中的降解、转化，迁移、归趋以及对坏境生物造成的影响。胂制剂的环境污染问题，已逐渐成为有胂制剂研究的重点，并在国际上形成新的研究热点，在我国在这方面研究目前处于起步阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于洛克沙胂含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

(1)包被有洛克沙胂偶联抗原的酶标板；

(2)洛克沙胂标准品溶液；

(3)浓缩酶结合物；

(4)酶结合物稀释液；

(5)底物显色液；

(6)终止液。

所述洛克沙胂偶联抗原为洛克沙胂半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述洛克沙胂半抗原制备过程：

1)取20mg洛克沙胂，10ul，1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2ml

N，N’-二甲基甲酰胺中，得到I液；

2)取20mgN，N’-二环己基碳二亚胺溶解于0.5mlDMF中，得到II液；

3)在0℃条件下，将II液缓慢滴加至I液中，恢复室温后，继续反应20h；

4)蒸除溶剂，柱层析(洗脱液：二氯甲烷／甲醇，体积比20：1)，得到洛克沙胂半抗原。

所述浓缩酶结合物为酶标记的洛克沙胂单克隆抗体，所述标记酶为辣根过氧化物酶；酶结合物是采用过碘酸钠法将标记酶与抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括洛克沙胂标准品溶液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液。

所述的终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸溶液，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，底物液A液为过氧化脲溶液，底物液B液为四甲基联苯胺溶液。

所述的酶结合物稀释液为PH7.2~7.4，0.5%~1%牛血清白蛋白，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

其中酶标板在制各过程中所用的包被缓冲液为pH9.6，0.1mol/L碳酸盐缓冲液，

所用封闭液为PH7.2~7.4，0.5%~1%牛血清白蛋白，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.1~0.2ug/ml,每孔加入100ul，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200ul封闭液，37℃温育l~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被洛克沙胂偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，样本中残留的洛克沙胂与酶标板上预包被的洛克沙胂偶联抗原竞争洛克沙胂的酶结合物，用底物显色液显色，样本吸光值与所含洛克沙胂的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中洛克沙胂的含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的洛克沙胂标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中洛克沙胂的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒洛克沙胂的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；