[发明专利]一种用于莫能霉素快速检测的酶联免疫试剂盒

权利要求书

1.一种用于莫能霉素快速检测的酶联免疫试剂盒，其特征在于它包含下列成分：

（1）包被了莫能霉素抗原的酶标板；

（2）莫能霉素抗体；

（3）莫能霉素标准品；

（4）标准品稀释液；

（5）酶标二抗；

（6）底物显色液；

（7）洗涤缓冲液；

（8）终止液；

其中，本发明的试剂盒所用试剂的配制方法如下：

（1）莫能霉素标准溶液配制：准确称取标准莫能霉素1mg，精确到0.00001g，配成1μg/mL标准品溶液母液；使用时，用标准品稀释液稀释成所需的浓度（10-1000ng/mL）；

（2）标准品稀释液为0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，0.9%NaCl的缓冲液；

（3）包被缓冲液为0.1mol/L碳酸缓冲液，pH7.8，含0.05%NaN₃，0.9%NaCl；

（4）封闭液为0.05mol/LTris-HCl溶液，pH8.0，含0.5%BSA，0.9%NaCl，0.04%NaN₃；

（5）洗涤缓冲液为0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，0.9%NaCl，0.04%Tween20；

（6）莫能霉素单克隆抗体工作液：将抗体用pH7.4，0.02mol/L，含1%卵清蛋白的磷酸盐缓冲液稀释成蛋白浓度为0.1-1ug/L使用；

（7）酶标二抗工作液：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；

（8）底物显色液A液：过氧化氢或过氧化脲；

（9）底物显色液B液：邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TMB）；

（10）底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液：pH8.1，含有MgCl₂0.01%100mmol/LTris-HCl；

（11）终止液：2mol/L硫酸。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于包被抗原的制备：将载体蛋白（BSA）的羧基用乙二胺活化，再通过水溶性碳化二亚胺法（EDC）将莫能霉素与活化载体蛋白（BSA）的氨基相偶联制备莫能霉素抗原。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于莫能霉素单克隆抗体制备：

a、动物免疫程序：采用莫能霉素人工抗原为免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫剂量为50μg，首次免疫为含弗氏完全佐剂的免疫原，颈背部皮下多点注射，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，可以得到血液里含有莫能霉素特异性抗体的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞

b、细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞，按照5:1的比例与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，筛选能稳定分泌莫能霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株

c、单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将BALB/C小鼠腹腔注入0.5mL灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水，经硫酸铵盐析纯化，分装待用，-20℃保存。