[发明专利]检测辛硫磷的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测辛硫磷的酶联免疫试剂盒，其适用于饲料(原料、配合料、浓缩料)中辛硫磷测定。

技术背景

辛硫磷又称肟硫磷、倍腈松、腈肟磷．易与土壤中有机质结合．适合于防治地下害虫．对危害农作物、果树、蔬菜、桑、茶等作物的多种鳞翅目害虫的幼虫有良好的防治效果．对虫卵也有一定的杀伤作用。目前．辛硫磷作为高效、广普、低毒的杀虫剂．被认为是甲胺磷、乐果等高毒农药的替代品．在当前应用较广．我国对辛硫磷的检测限量标准有GB14858一

1994。为评价辛硫磷施用后的环境行为有必要研究辛硫磷在玉米深加工产品如蛋白粉、蛋白饲料中的残留检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于辛硫磷含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

(1)包被有辛硫磷偶联抗原的酶标板；

(2)辛硫磷标准品溶液；

(3)浓缩酶结合物；

(4)酶结合物稀释液；

(5)底物显色液；

(6)终止液。

所述辛硫磷偶联抗原为辛硫磷半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述辛硫磷半抗原制备过程：

1)取20mg辛硫磷，10ul，1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2ml

N，N’-二甲基甲酰胺中，得到I液；

2)取20mgN，N’-二环己基碳二亚胺溶解于0.5mlDMF中，得到II液；

3)在0℃条件下，将II液缓慢滴加至I液中，恢复室温后，继续反应20h；

4)蒸除溶剂，柱层析(洗脱液：二氯甲烷／甲醇，体积比20：1)，得到辛硫磷半抗原。

所述浓缩酶结合物为酶标记的辛硫磷单克隆抗体，所述标记酶为辣根过氧化物酶；酶结合物是采用过碘酸钠法将标记酶与抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括辛硫磷标准品溶液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液。

所述的终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸溶液，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，底物液A液为过氧化脲溶液，底物液B液为四甲基联苯胺溶液。

所述的酶结合物稀释液为PH7.2~7.4，0.5%~1%牛血清白蛋白，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

其中酶标板在制各过程中所用的包被缓冲液为pH9.6，0.1mol/L碳酸盐缓冲液，

所用封闭液为PH7.2~7.4，0.5%~1%牛血清白蛋白，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.1~0.2ug/ml,每孔加入100ul，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200ul封闭液，37℃温育l~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被辛硫磷偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，样本中残留的辛硫磷与酶标板上预包被的辛硫磷偶联抗原竞争辛硫磷的酶结合物，用底物显色液显色，样本吸光值与所含辛硫磷的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中辛硫磷的含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的辛硫磷标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中辛硫磷的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒辛硫磷的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明检测辛硫磷的酶联免疫试剂盒主要采用竞争ELISA方法检测样品中辛硫磷的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、准确度高、精确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，携带便利、使用方便、结构简单、检测方法快速、简便、适于大批量样品筛选。

附图说明

图1为辛硫磷半抗原结构式。

图2为试剂盒的标准曲线图。

具体实施方式