[发明专利]一种猪精液的冷冻和解冻方法

权利要求书

1.一种猪精液的冷冻和解冻方法，包含以下步骤：

(一)、猪精液的冷冻过程：

①首先采集优秀的种公猪精液，用精子密度仪测出其内部精子密度，然后在37-40℃的温度下用稀释剂稀释该精液，使其最终活精子数与整体公猪精液的比例为0.51∶1，稀释后将该精液在17-20℃的室温环境下平衡0.5-1h。

②将上述①中的精液移入15℃的环境下降温，平衡3h。

③取上述②中的精液800g，使其在15℃的环境下离心10min，先加入无甘油的稀释液I，然后温度缓慢降至5℃，平衡2h后，再加入含甘油的稀释液II，然后用细管进行分装。

④取上述③中分装好的精液开始进行冷冻过程：

精液所处环境，初始温度为5℃，以3℃/min的速率从5℃降到-5℃，再于-5℃条件下保持1min结晶，然后以50℃/min的速率从-5℃降到-140℃，最后将精液放入广口液氮罐内与液氮面距离5cm处，熏蒸20min，再投入液氮保存。

(二)、猪精液的解冻过程：迅速取出于液氮中保存的冷冻的猪精液，与冷冻原理相反，温度以50℃/min的速率从-140℃升至-5℃，再以3℃/min的速率从-5℃升至5℃，解冻即可。

(三)、猪精液的检测：取解冻后的猪精液，通过电子生物显微镜和计数板对其精子活力、畸形率、有效精子数进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种猪精液的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述精液采用5mL大型细管Maxi-straw进行冷冻解冻。

3.根据权利要求1所述的一种猪精液的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述猪精液冷冻过程①中所述的稀释剂配方为D-葡萄糖37.15g、柠檬酸三钠6.00g、EDTA钠盐1.25g、碳酸氢钠1.25g、氯化钾0.75g、青霉素钠0.60g、硫酸链霉素1.00g或D-葡萄糖60.00g、柠檬酸三钠3.70g、EDTA钠盐3.70g、碳酸氢钠1.20g、青霉素钠50万单位、硫酸链霉素0.50g。

4.根据权利要求1所述的一种猪精液的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述猪精液冷冻过程③中所述的稀释液I和稀释液II的配方为：D-葡萄糖11.5g、柠檬酸三钠11.65g、EDTA钠盐2.35g、磷酸二氢钾1.75g、氰化钾0.75g、硫酸链霉素0.5g、聚乙烯醇(PVP.Typell)1.0g、三羧甲基氨基甲醇(Tris)5.5g、柠檬酸4.1g、半盘氨酸0.07g、OEP(氨基-钠十二烷基硫酸酯)0.4g、SDS(十二烷基硫酸钠)0.3g、PGF2a 0.5g、维生素E 0.5g、GSH(谷胱甘肽)0.5g、透明质酸0.3g、N-乙酰基-D-氨基葡糖0.5g。