[发明专利]一种适用于PCR或HRM检测分析的微流控芯片及检测装置

说明书

技术领域

本发明涉及微流控芯片的技术领域，具体涉及一种适用于PCR或HRM检测分析的微流控芯片及检测装置。

背景技术

微流控芯片作为新型的微纳分析技术平台，将生物和化学等领域所涉及的样品制备、分离与检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，具有多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成的特征和优势。微流控芯片具有节约空间和试剂、热容量小、升降温速率快、易于集成化等优点。微流控芯片在装置上的主要特征是其容纳流体的有效结构(包括通道、反应室和其他某些功能部件)至少在一个维度上为微米级尺度。与宏观尺度的实验装置相比，微流控芯片的微米级结构显著增大了流体环境的面积/体积比例。这一变化在微流控系统中导致一系列与物体表面有关的、决定其特殊性能的特有效应。这些效应大多数使微流控芯片的分析性能显著超过宏观条件下的分析体系。

高分辨率熔解(high-resolution melting,HRM)曲线分析是近年来在实时荧光PCR基础上发展起来的一门新兴技术。HRM是基于核酸的物理性质，根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，对PCR产物的熔解曲线进行分析，其极高的温度均一性和分辨率使其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分，从而完成对样品的序列分析。基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的突变分析法和定量探针法，在确保结果准确的基础之上，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，可广泛应用于检测单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR)和插入/缺失等多种DNA变异，物种鉴定、遗传图谱构建、基因定位及分型、等位基因频率分析、甲基化研究等多个研究领域，已成为近年来国外新兴遗传学、方法学研究和应用的热点。

HRM有专用荧光染料，目前市场上的饱和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO9等几种。SYBR Green I就属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。饱和染料在饱和浓度(荧光最大)下，也不会抑制PCR。高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，所以高的分辨率能区分熔解曲线。

扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。对于做高分辨率熔解曲线分析的仪器，在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，即达到0.1℃区分。此外，温度均一性也要求两孔之间温度相差小于0.1℃，否则可能导致最终的熔解温度相差0.1℃，就无法保证HRM分析结果的准确性。

目前市场上销售的具备高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting，HRM)功能的荧光定量PCR仪仅有三款，均为国外公司生产。有关HRM研究在国内开展的还比较少，其核心技术主要掌握在国外几家知名生命科学仪器研发公司。美国犹他大学保健科学中心病理学部Carl Wittwer实验室联合美国Idaho Technology公司，在实时荧光分析技术的基础之上，于2006生产出世界上第一台HRM仪器HR-1。该设备具有精确的温度控制系统，并结合了高速的数据采集技术，配合使用高分辨的饱和LC Green荧光染料，使其具有超高的灵敏度和特异性，但HR-1不具备PCR热循环性能，每次只能分析单个样本并要结合Lightcycler系列毛细管PCR扩增仪使用，且分析结束后产物不易取出，难以用于下游分析，HR-1在应用中实用性较差。罗氏公司的LightScanner使用改良过的热模块设计，敏感性和特异性好，整个微孔板的检测同时进行，但其尽管应用先进的工程技术，仍然无法避免孔与孔之间的热学和光学的差异影响，温度和光照均一性没有得到妥善解决。Qiagen公司的Rotor-Gene 6000是首款具有热循环和HRM性能的多孔仪器，实现了PCR扩增和产物分析在同一管中完成，节约了时间，减少了污染，但是也同样具有热学和光学非均一性的缺点。