[发明专利]一种细胞裂解方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，尤其涉及一种细胞裂解方法以及使用该细胞裂解方法获得的细胞裂解物直接进行PCR的方法。

背景技术

在过去数十年中，PCR已成为用于DNA分析的“役用马(workinghorse)”,因为它允许指数扩增核酸。然而，进一步改善用于PCR分析的作业流程仍是挑战，特别是如果分析仅可以对源于较小数目细胞的DNA执行。

此外，在转基因动物细胞的筛选及鉴定过程中，要获得表达量高的细胞株或双敲除的细胞株往往需要对许多细胞克隆进行PCR鉴定，而基因组DNA模板的制备对PCR的扩增必不可少。传统的DNA抽提方法为酚-氯仿抽提法，但该方法耗时耗力，步骤繁琐，而且酚-氯仿对人体有毒，因此该方法用的很少。目前DNA提取主要通过商业化的DNA提取试剂盒。但是商业化试剂盒同样需要经过细胞裂解、DNA乙醇(异丙醇)沉淀和70％乙醇清洗三步把DNA提取出来，耗费时间和精力，且成本较高。如果将细胞直接裂解后以裂解液作为模板进行PCR，不仅节省时间精力，而且成本低廉，十分适合高通量细胞鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提出一种可以用于直接进行PCR的细胞裂解方法，以及用该裂解方法的细胞裂解物直接进行PCR的方法；本发明的用细胞裂解物直接进行PCR的方法不但能绕开DNA提取步骤，省时省力，而且其扩增效率高，以较少细胞的裂解物即能进行PCR检测。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种细胞裂解方法，所述方法包括：

(1)将待测细胞与细胞裂解液按比例进行混合；所述细胞裂解液包括Tris-HCl、EDTA和蛋白酶K；

(2)将步骤(1)所得混合物在30℃～70℃孵育5～30min，然后在92-98℃变性8～12min。

对于上述细胞裂解方法：

步骤(1)中，作为优选，所述细胞裂解液包括≤100mM的Tris-HCl、≤30mM的EDTA和≤300μg/ml的蛋白酶K，其pH为7.6-8.4；

进一步优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μg/ml的蛋白酶K，其pH为7.8-8.2；

更进一步优选地，所述细胞裂解液包括10mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和100μg/ml的蛋白酶K，其pH为8.0。

此外，步骤(1)中，作为优选，待测细胞与细胞裂解液的混合比例为800000-1500000个细胞/ml裂解液，优选为1000000个细胞/ml裂解液。

步骤(2)中，作为优选，所述孵育为在40℃～60℃孵育5～30min，更优选在55℃孵育5min。

步骤(2)中，作为优选，所述变性为在94-96℃变性8～12min，更优选在95℃变性10min。

上述细胞裂解方法中，所述待测细胞为动物细胞；优选地，所述待测细胞为猪、小鼠或人类的各种细胞。

第二方面，本发明提供了一种用细胞裂解物直接进行PCR的方法，该方法为：使用如第一方面所述的细胞裂解方法裂解细胞，将所得细胞裂解物加入反应体系中直接进行PCR。

上述方法中，作为优选，每个PCR反应体系中使用500～60000个细胞的裂解产物，更优选使用4000～30000个细胞的裂解产物，最优选使用20000个细胞的裂解产物。

发明人发现，在用细胞裂解物直接进行PCR的实验中，从500～60000个细胞的裂解物中都能扩增出目的条带，其中从4000～30000个细胞的裂解物中扩增的条带较亮，扩增效率较好。因此，进行PCR检测的优选最低细胞裂解量为4000个细胞，最佳细胞裂解量为20000个。

在一个优选的实施方案中，每20μLPCR反应体系的组成如下：

4μL5×HFbuffer，0.5μLdNTP(各2.5mM)，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1μL细胞裂解液，0.2μLphusion酶，用ddH₂O补足至20μL；所述细胞裂解液的配方为：10mMTris-Cl(PH8.0)，10mMEDTA(PH8.0)，200μg/mL蛋白酶K。

优选地，所述PCR反应程序如下：

98℃，30s；(98℃，10s；60℃，20s；72℃，30s～2min；)×30～35个循环；72℃，10min；16℃，2min。

本发明的用细胞裂解物直接进行PCR的方法可扩增出长度达3200bp的DNA。