[发明专利]零背景克隆载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地，涉及零背景克隆载体及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及制备零背景克隆载体的方法、零背景克隆载体及其在制备目的基因克隆载体中的用途，以及制备目的基因克隆载体的方法。

背景技术

现阶段的遗传工程涉及大量的基因克隆技术，将基因片段插入到克隆载体中，方便长期保存基因以及下游的分子生物学操作。市场上常见的克隆载体比如带胸腺嘧啶T突出末端的载体(以下简称T载体)大多是应用β-半乳糖苷酶基因进行蓝-白斑筛选，劣势在于蓝白斑比例较高，且白斑中也存在假阳性的情况，每个平板上涂上5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(以下简称X-Gal)及异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(以下简称IPTG)的步骤也比较繁琐。T载体只能直接连接末端带有腺嘌呤碱基A尾的脱氧核糖核酸(以下简称DNA)片段，Taq酶等类似的聚合酶的保真度不如高保真酶，扩增出的片段存在错配的风险。当插入片段大于3千碱基时候，克隆效率非常低下。

而除了T载体之外，目前也有一些有关含毒性基因的零背景载体的报道，这种新型的零背景平端克隆载体可以避免一些常见载体的缺点。但是，利用毒性基因构建载体时，为了扩繁质粒载体，一般采用阻断序列将毒性基因的阅读框破坏使基因不能表达，从而有可能导致存在微量未酶切干净的质粒的干扰，对载体的质量有一定影响。

因而，现阶段急需一种能够有效解决上述问题的零背景平端克隆载体。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够直接用于平末端产物的连接，降低载体自连的背景，提高克隆的阳性率，并能够在短时间内实现快速有效的克隆的零背景克隆载体。

首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

核糖核酸酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO；1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，编码一种核糖核酸酶，可以降解核糖核酸(以下简称RNA)，在没有其抑制蛋白时对细胞来说是致死的。例如，在基因克隆载体中常用的复制子能够在大肠杆菌中高效的复制，每个细胞中拷贝达到200－300个，但是，在乳糖启动子(以下简称Lac启动子)、乳糖和色氨酸的杂合启动子(以下简称Tac启动子)，以及突变的乳糖启动子形式(以下简称Lac UV5启动子)等启动子驱动下，核糖核酸酶基因可以大量表达，将杀死大肠杆菌细胞，因此，核糖核酸酶对普通的大肠杆菌来说都是致死的。并且，利用组织特异性表达的启动子能够有效驱动核糖核酸酶基因在宿主的该组织中特异表达。

细胞致死毒性(Control of cell death，以下简称ccdB)基因表达一种毒性蛋白，在缺乏抗毒素的情况下，干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制普通大肠杆菌的生长，杀伤宿主细胞。而DB3.1的大肠杆菌可以耐受含有ccdB基因的质粒繁殖，方便质粒的提取。利用DB3.1的大肠杆菌来繁殖载体，通过增加核糖体结合位点序列，让ccdB基因在DB3.1菌株中高量表达，可以降低未酶切干净载体转化造成的背景。

发明人发现，采用双毒基因的构建策略构建零背景克隆载体：采用ccdB毒性基因作为零背景载体的间隔序列，即通过ccdB基因的序列阻断破坏核糖核酸酶基因(内含多克隆位点)的阅读框，一方面可以使核糖核酸酶基因保留在载体上但不表达，当切去ccdB基因即可得到目的载体，核糖核酸酶基因就可以表达，而插入外源片段后又破坏了核糖核酸酶基因的阅读框引起蛋白失活，从而达到零背景克隆的效果；另一方面，在载体酶切时，常常会有极少量的比如变性超螺旋的质粒酶切不完全，而通过引入ccdB基因，完整的未酶切完全的质粒将不能表达，这可以保证载体的质量。含有核糖核酸酶基因完整阅读框的零背景克隆载体可以在自身环化后杀死大肠杆菌细胞，只有成功连接外源基因的载体才可以在平板上长出菌落。这种阳性筛选策略无需蓝白筛选，能够大大加速克隆筛选进程。

目前，尚未有使用编码核糖核酸酶的基因来构建零背景载体进行平端克隆的报道。