[发明专利]毛细管电泳在线反应分离蛋白质‑寡核酸复合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，属于生物分离分析技术领域。

背景技术

单链寡核苷酸(single-stranded DNA,ssDNA)或RNA具有特定二级结构，可以与蛋白质分子形成高亲和性和特异性的复合物。寡核苷酸文库是一类含有10¹³～10¹⁵种不同碱基的单链DNA分子(ssDNA)混合物，其中可能含有一种或数种能与靶分子具有高特异性，高亲和性结合的ssDNA，即核酸适配体(Aptamer)。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术，从随机寡核苷酸文库中筛选得到的，具有与靶分子高亲和性和高特异性的寡核苷酸序列配体，其特性是亲和力高、特异性强、易制备及修饰，并且靶分子分布广。由于在生物，医药以及分子识别和检测方面有重要的应用价值，目前已经发展出多种核酸适配体的筛选方法，如亲和色谱，膜过滤，磁珠分离及毛细管电泳等。

毛细管电泳(CE)具有高效、快速以及实验成本低等优点，是新型的微量分离分析技术，在蛋白质的核酸适配体筛选中有广泛的应用。

CE用于SELEX筛选核酸适配体即为CE-SELEX。CE-SELEX可使核酸适配体筛选周期缩短至传统SELEX技术的三分之一，大大加快了筛选效率。由于传统的CE-SELEX技术中，需将初始的ssDNA文库与靶分子混合孵育，并需要对孵育的温度、时间以及ssDNA文库与靶分子的比例做一系列优化，使操作复杂、耗时且样品耗费大。

发明内容

针对传统的CE-SELEX技术筛选适配体时，靶分子用量大、反应条件优化过程繁琐以及耗时费力的缺陷，本发明的目的在于提供一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，所述方法基于毛细管电泳的在线反应及分离方法，用于靶分子核酸适配体的高效筛选。

为实现本发明的目的，采用的技术方案如下。

一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，所述在线反应为本领域常用术语，是指在毛细管区带电泳时毛细管中的反应，所述方法步骤如下：

对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：毛细管中迁移速率慢的反应物，电泳缓冲溶液，毛细管中迁移速率快的反应物，使迁移速率不同的反应物在所述电泳过程的毛细管中实现在线反应混和后完成电泳，分离收集电泳产物，对所述产物进行毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测；所述反应物为蛋白质和ssDNA，根据本领域毛细管区带电泳的要求制成样品溶液后进样。

优选在电泳缓冲液中加入反应物之一，可抑制复合物在所述电泳过程中解离，进而促进较弱复合物的形成。

其中，所述毛细管中的迁移速率可通过分别对反应物，即蛋白质和ssDNA进行毛细管区带电泳，根据所述反应物的出峰时间确定，先出峰的反应物迁移速率快。

通过改变所述反应物的进样时间，即进样量，可获得不同反应物的最佳进样量比例。

所述反应物可通过以下方法制成样品溶液进样：将蛋白质溶于纯水中制成原始蛋白质储备液，将ssDNA溶于纯水中制备成原始ssDNA储备液；将原始蛋白质储备液稀释后得到蛋白质样品溶液，将原始ssDNA储备液稀释后得到ssDNA样品溶液。

优选确定反应物在毛细管中的迁移速率时的毛细管区带电泳使用涂层毛细管，可抑制蛋白质在管壁的吸附，可采用总长度48.5cm，有效长度40cm，内径75μm的毛细管；可使用Agilent 7100毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液可为硼酸硼砂溶液，可通过将50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件可为：50mbar下，进样3s～25s，分析条件可为：分析温度25℃，分析电压-15kV；可使用UV 195nm进行检测。