[发明专利]一种恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种恒河猴外周血单核巨噬细胞的培养和鉴定方法。

背景技术

巨噬细胞分布于机体的多种组织中，其功能不仅仅限于清除体内垃圾，并且在机体的不同组织和器官中也发挥了监视入侵病原微生物及诱导天然免疫应答等多种生理功能。在机体与病原微生物密切接触的免疫前沿器官内有大量巨噬细胞，如淋巴系统、肺、肠的固有层等。巨噬细胞“常驻”各组织器官中，通过清除凋亡和坏死细胞及外来入侵微生物，发挥其生理平衡和免疫功能(Gordon S,Taylor PR:Monocyte and macrophage heterogeneity.Nature Reviews Immunology[J]2005；5:953-964)。巨噬细胞可引起适度的对抗感染的免疫反应，能通过吞噬和识别病原微生物诱导天然免疫，亦可通过发挥抗原递呈功能激活T细胞，从而引起获得性免疫应答(Peiser L,Gordon S:The function of scavenger receptors expressed by macrophages and their role in the regulation of inflammation.Microbes and Infection[J]2001；3:149-159；Peiser L,Mukhopadhyay S,Gordon S:Scavenger receptors in innate immunity.Current Opinion in Immunology[J]2002；14:123-128；Aderem A:Phagocytosis and the inflammatory response.Journal of Infectious Diseases[J]2003；187:S340-S345)。

分离培养巨噬细胞对免疫学与病毒学等相关研究十分重要，因此，有必要建立分化培养巨噬细胞的方法。由于组织中的巨噬细胞很难分离和富集，使用外周血单核细胞体外分化培养巨噬细胞，建立体外培养单核细胞来源的巨噬细胞已成为广泛接受的科学手段。尽管已有诸多有关体外分化培养人巨噬细胞的方法学的报道(Plesner A:Increasing the yield of human mononuclear cells and low serum conditions for in vitro generation of macrophages with m-csf.Journal of immunological methods[J]2003；279:287-295；Plesner A,Greenbaum CJ,Lernmark Low serum conditions for in vitro generation of human macrophages with macrophage colony stimulating factor.Journal of immunological methods[J]2001；249:53-61；Gersuk G,Hiraoka A,Marr KA:Human monocytes differentiate into macrophages under the influence of human kpb-m15 conditioned medium.Journal ofimmunological methods[J]2005；299:99-106)，但有关体外培养非人灵长类动物单核巨噬细胞的报道却十分有限。鉴于非人灵长类动物，已被广泛用于作为人类疾病的模型来研究，建立体外培养非人灵长类动物原代单核巨噬细胞的方法十分必要。Rozner等在RPMI-1640中加入1％人血清、M-CSF及IL-1β成功使用恒河猴外周血单核细胞分化培养巨噬细胞(Rozner AE,Dambaeva SV,Drenzek JG,Durning M,Golos TG:Generation of macrophages from peripheral blood monocytes in the rhesus monkey.Journal of immunological methods[J]2009；351:36-40)；Sisk等利用恒河猴和短尾猴的外周血，通过在HBSS培养基中加入M-CSF及20％的自体血清，体外分化培养猕猴原代巨噬细胞(Sisk JM,Witwer KW,Tarwater PM,Clements JE:Siv replication is directly downregulated by four antiviral mirnas.Retrovirology[J]2013；10:95)。尽管这些方法的确能在体外分化培养猴巨噬细胞，但这些方法存在以下缺点：1)需在培养基中加入细胞生长因子，除了大大增加实验的费用外，这些细胞生长因子(巨噬细胞集落刺激因子M-CSF和白细胞介素IL-1β等)在促进单核细胞分化成巨噬细胞的同时，也能激活巨噬细胞，干扰实验结果；2)由于人血清中的多种抗原成分可激活或抑制非人灵长类动物巨噬细胞，因此，在培养基中加入人血清也会直接或间接地影响实验数据；3)尽管将高浓度的自体血清用于体外分化培养单核巨噬细胞没有环境改变的影响，含有能够最大限度的满足细胞生长分化所需要的各种理化因素，但用于试验的非人灵长类动物如猕猴体重仅仅4～5kg,与人类比较个体非常小,全身血容量少，因此需要在保证体外分化培养的巨噬细胞正常生长的前提下降低自体血清的用量。