[发明专利]一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于树突状细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，属于细胞工程与生物医药技术领域。

背景技术

肿瘤已经成为继心血管疾病以外威胁人类健康的第二大杀手。目前，治疗肿瘤的手段主要包括手术，放疗和化疗，除此以外，肿瘤免疫治疗已成为临床的第四大治疗方法，具有十分广阔的应用前景。根据机体抗肿瘤的免疫效应机制，肿瘤免疫治疗可分为两类：主动免疫治疗和被动免疫治疗。

主动免疫治疗又包括非特异性主动免疫治疗和特异性主动免疫治疗。非特异性主动免疫治疗是指应用一些免疫调节剂通过非特异性地增强机体的免疫功能，激活机体的抗肿瘤免疫应答以达到治疗肿瘤的目的。特异性主动免疫治疗是指调动宿主自身的抗肿瘤免疫机制，采用“瘤苗”给患者接种以诱导特异性肿瘤免疫反应。目前治疗用的瘤苗主要有肿瘤细胞瘤苗、基因工程疫苗、抗独特型抗体瘤苗、抗原提呈细胞为基础的瘤苗。肿瘤的主动免疫疗法与传统免疫疫苗的概念不同，主要不是用于肿瘤的预防，而是给机体输入具有抗原性的肿瘤疫苗，刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫，以达到治疗肿瘤、预防肿瘤转移和复发的目的。

肿瘤细胞疫苗是肿瘤疫苗的一种，其是指将自身或同种异体的肿瘤细胞，经过物理因素(照射、高温)、化学因素(酶解)以及生物因素(病毒感染、基因转移等)的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，对肿瘤治疗有一定疗效。

树突状细胞(Dendritic Cells，DC)也是肿瘤疫苗的一种，DC是人体内抗原递呈能力最强的细胞，具有强大的T细胞激活能力，并能活化初始型T细胞、刺激B淋巴细胞增殖成熟、刺激Th细胞及NK细胞活性。DC能够诱导特异性抗肿瘤细胞毒T淋巴细胞(CTL)，引发机体产生抗肿瘤免疫应答。它不仅能够激活自体的抗肿瘤免疫，同样能够提高异体的抗肿瘤效应。因此，利用树突状细胞制备肿瘤疫苗可望提供一种有效的肿瘤免疫治疗方法。通常情况下，人体内的DC细胞数量很少，只有在抗原递呈细胞正常发挥抗原递呈作用的时候，身体才能有效识别病原，激活全身性免疫系统，产生正常的免疫反应。DC细胞治疗是指通过采用患者自体的单个核细胞在体外培养诱导生成DC，然后负载相应的肿瘤抗原，制成负载肿瘤抗原的DC细胞，再将这些DC细胞回输入患者体内，刺激体内的肿瘤杀伤性T淋巴细胞增殖，发挥长期监视肿瘤作用和杀伤肿瘤作用，达到消灭肿瘤的目的。

目前DC肿瘤疫苗的制备方法包括：应用肿瘤抗原肽致敏DC、应用肿瘤细胞的蛋白提取物致敏DC、应用肿瘤抗原编码基因致敏DC、应用肿瘤全细胞抗原致敏DC等。由于目前肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原多肽获得明确鉴定的较少，因此以全部肿瘤抗原信息致敏DC成为一种简便有实效的方法。如何通过安全、有效的方法制备DC细胞成为了本领域亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于树突状细胞(Dendritic Cells，DC)的特异性肿瘤疫苗的制备方法。具有安全有效、简单易行、易于推广实践等优点，可通过本方法为临床提供肿瘤治疗用途的DC疫苗。

为达到上述目的，本发明提供了一种基于DC细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法，其是利用高静水压(High Hydrostatic Pressure，HHP)制备具有强免疫原性肿瘤抗原，联合黄芪多糖(Astragalus Polysaccharids，APS)作为免疫佐剂，在体外对树突状细胞进行活化，进而高效刺激抗原特异性T淋巴细胞的激活，引发机体发生抗肿瘤特异性免疫反应。其包括以下步骤：

在体外对肿瘤组织或肿瘤组织来源的细胞在一定适当温度下利用适当强度的HHP进行处理，引发肿瘤细胞发生凋亡；在肿瘤细胞发生凋亡的48小时后，可以检测其免疫原性细胞死亡标记表达水平；

将HHP处理后的肿瘤细胞与适量的APS溶液混合，然后对人单个核细胞(PBMC)来源的DC细胞进行活化，得到所述疫苗；可以使用流式细胞仪对DC细胞特定表面分子表达量的水平进行检测，检测DC的成熟度；将自体淋巴细胞与一定比例的成熟DC细胞进行混合培养，检测特异性T淋巴细胞的激活情况。