[发明专利]一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途。

背景技术

牛边缘无浆体病是一种由边缘无浆体经蜱传播的专性寄生于红细胞内的血液传染疾病，主要引起牛、羊等反刍动物发病，。其特征为高热、贫血、消瘦、黄疸和胆囊肿大并广泛分布于世界热带和亚热带地区引起奶牛和肉牛产业相当大的经济损失(Katherine et al.，2010)。检测牛边缘无浆体的常见基因包括16S rRNA，热休克蛋白(groEL基因)(Lew et al.，2003)，主要表面蛋白-1a(Msp1a)(Lew et al.，2002；Molad et al.，2004)，Msp4(Molad et al.，2004)和Msp5(Molad et al.，2004；Corona et al.，2009)。牛边缘无浆体主要表面蛋白Msp5是由633bp单拷贝基因编码高度保守的19ku的蛋白，在免疫印迹试验中通过与单克隆抗体表面蛋白结合，Msp5 ANAF16C1证明在已知的无浆体属的几个亚种中是高度保守的(Visser et al.，1992；et al.，2012)。因此，Msp5可以作为一种有效的诊断抗原。传统的检测边缘无浆体Msp5基因的方法是竞争性酶联免疫吸附法(CELISA)(Strik et al.，2007；Echaide et al.，1998)竞争抑制性酶联免疫吸附法(CI-ELISA)(NI et al.，2011)，间接荧光抗体试验(IFAT)(OIE，2009)，套式PCR法(Echaide et al.，1998)，实时荧光定量PCR(Picoloto et al.，2010)和半套式PCR测定法(Singh et al.，2012)。但是这些方法还有许多缺陷，例如，它们必须在实验室进行并且反应需要很长的时间。自2000年以来，Notomi开发出了环介导等温扩增方法(LAMP)，在恒温条件(60℃-65℃)下，不到1h的时间里进行核酸扩增，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。环介导等温扩增技术已经广泛应用于快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫)(Tomita et al.，2008)。然而，使用LAMP技术诊断牛边缘无浆体病尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，根据牛边缘无浆体保守基因Msp5设计了引物，评估LAMP技术的检测方法。

其具体技术方案为：

一种环介导等温扩增引物在制备检测牛边缘无浆体病原的试剂中的用途，

特异性LAMP引物根据Msp5基因设计3对引物：外，内，环引物，正向外引物命名为Msp5-F3b，反向外引物命名为Msp5-B3b，正向内引物命名为Msp5-FIPb，反向内引物命名为Msp5-BIPb，为了加速反应设计环路引物，其中包括正向环引物Msp5-LFb和反向环引物Msp5-LBb，三对的外引物用于PCR检测；

优选地，采用以下步骤完成：

LAMP反应体系是25μL，包括0.4μM外引物(Msp5-F3和Msp5-B3)，1.6μM内引物(Msp5-FIP和Msp5-BIP)，0.8μM环引物(Msp5-LF和Msp5-LB)，1μLDNA样品，硫酸镁1mM dNTP Mix1mM(TAKARA BIO INC.，Japan)，1mM甜菜碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，2.5μL10×Thermopol buffer(New England Biolabs，Inc.，MA)1U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.，MA)，加ddH₂O共25μL。混匀后，加入20μL油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)混匀并离心。在PCR管的中下部加入0.5μL SYBR GREEN I染料(Sigma-Aldrich St.Louis，MO)然后轻轻盖上，以防止SYBR GREEN I染料降入管底。将混合物在63℃下恒温反应20分钟。反应后，在光亮视野下观察到混合物与SYBR GREEN I染料在PCR管中的颜色变化，并在紫外线照射下365nm处也可观察到。之后LAMP产物(3μL)用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：