[发明专利]体液中乳糖测定方法

说明书

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测体液中乳糖的测定方法。

背景技术

乳糖是二糖的一种，分子式是C₁₂H₂₂O₁₁，是在哺乳动物乳汁中的双糖，因此而得名，它的分子结构是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖缩合形成，味微甜，摩尔质量342.3克，有两种端基异构体：α-乳糖和β-乳糖，在水溶液中可互相转化，α-乳糖很容易结合一分子结晶水，甜度是蔗糖的约五分之一，乳汁中2～8％的固体成分为乳糖，幼小的哺乳动物肠道能分泌乳糖酶分解乳糖为单糖。成年动物，包括除高加索人种外的多数人类体内乳糖酶的活性大大降低，故饮用乳类可产生腹泻、腹胀等症状，称为乳糖不耐症，成年动物若长期持续饮用乳品(初期以少量多次慢饮为宜)，也可刺激肠道内乳糖酶的活性并增加一定数量，虽活性和数量不如幼儿时期，但仍能有效帮助分解乳糖，乳糖在人体中存在于乳汁中，当人体饮入乳品后，人体肠屏障破坏时可进入人体血液和尿液中。

目前国内测定乳糖有高效液相色谱-串联质谱法，高效液相色谱-蒸发光散射法，还有酶学分析法，通过乳糖酶分解乳糖生成L-半乳糖和葡萄糖，通过检测L-半乳糖的含量来确定乳糖的含量，如北京金域高科诊断技术有限公司生产采用尿半乳糖测定试剂盒，受检患者排空尿液，按正常饮食习惯哺乳，收集2～3h的尿液，混匀检测，乳糖经乳糖酶作用水解生成葡萄糖和半乳糖，半乳糖吸收入血后经尿液排出，尿液经尿液纯化装置处理除去干扰物，尿中半乳糖经半乳糖酶氧化酶作用生成半乳糖己二醛糖和过氧化氢，后者在四氨基安替吡啉存在下，使3，5-二氯-2-羟基苯磺酸氧化成红色，在一定范围内呈色深度与半乳糖浓度成正比，与试剂盒的标准品对照判读结果，样品孔颜色与标准孔一致或较标准孔浅为乳糖不耐受即乳糖不能被水解生成葡萄糖和半乳糖，尿中无半乳糖检验结果呈阳性为乳糖不耐受，反之乳糖耐受呈阴性。

本发明研究一种人体体液中乳糖测定方法，人体体液中葡萄糖和试剂Ⅰ中三磷酸腺苷、NADP在己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下，在镁离子的参与下反应生成NADPH，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，乳糖水解后生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖再循环第一步反应也生成NADPH；仪器在334～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NADPH为空白，由试剂Ⅱ反应产生的NADPH计算出乳糖的含量。

第一步反应：

第二步反应

发明内容：

生化分析仪检测体液中乳糖常采用酶法，人体体液中含有乳糖及葡萄糖，通过葡萄糖内空白法检测乳糖，人体体液中的葡萄糖与试剂Ⅰ中三磷酸腺苷、NADP在己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下，在镁离子的参与下反应生成NADPH，反应公式(1)(2)所示；当加入试剂II后，乳糖酶分解乳糖生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖再循环第一步反应也生成NADPH，反应公式(3)(4)(5)所示，乳糖水解产生的葡萄糖与乳糖含量呈等比关系，仪器在334～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NADPH为空白，由试剂Ⅱ反应产生的NADPH计算出乳糖的含量即为乳糖含量。本发明方法测定乳糖不受体液中葡萄糖含量的影响，通过内空白法消除了体液中的葡萄糖、内源性还原物质、脂浊、体液空白的干扰，为真正的乳糖含量。

为了解决现有技术中体液中内源性葡萄糖、脂浊、体液本身颜色对测定的干扰，本发明提供一种经济方便易行，准确性更高、适应于乳汁、血液、体液、尿液中乳糖检测，能够消除内源性干扰的体液中乳糖的测定方法。

本发明的技术方案是：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II仅有乳糖酶有效成分；其测定方法为：体液中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，体液中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成NADPH，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，乳糖水解后生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖经反应产生NADPH，334～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NADPH为空白，由试剂Ⅱ反应产生的NADPH计算出乳糖的含量。