[发明专利]肝癌干细胞疫苗及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术，涉及一种肿瘤干细胞疫苗及其制备和应用。 

背景技术

恶性肿瘤是一种全身性的慢性疾病。在中晚期患者体内，不仅脏器中有影像学检查时明显的团块肿瘤，在外周血中更有大量看不见的循环肿瘤细胞和肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)，随时准备定居在机体易感部位，发育成新的转移灶，这也是肿瘤无法根治的原因。传统的肿瘤治疗包括4种主要疗法，即手术、化疗、放疗和免疫治疗。通常前三种疗法治疗3-5年后，肿瘤都会发生周边脏器或远端脏器的转移。随着对CSC研究的深入，人们已经明确复发和转移的原因不是手术做得不彻底，而是由于缺乏有效的控制、甚至消灭CSC的方法。 

CSC来自人类自体干细胞的恶变，具有低分化度和高扩增性等特点。这些干细胞可抵抗几乎全部的传统化疗药物及放疗，可在传统治疗的同时即引起肿瘤肝复发和转移。这种现象对于很多免疫治疗也不例外，原因是过去一直使用成熟肿瘤细胞作为抗原供免疫细胞识别，而CSC不表达这些抗原，可逃避免疫攻击。所以，肿瘤的免疫治疗急需更新观念，将治疗的主攻方向从成熟肿瘤细胞转变为CSC。 

目前国际公认的成熟的寻找CSC的方法是利用ALDEFLUOR/ALDH在人类肿瘤中寻找。ALDH是所有干细胞中共有的一种酶，在肿瘤干细胞中高或强表达，而在普通干细胞中弱或无表达。 

目前，为了获得肿瘤干细胞(CSC)，人们常通过大量培养普通的肿瘤细胞系，由单瓶消化扩增至多瓶，再提取出其内的肿瘤干细胞。采用这种方法，其存在很多弊端：获取的肿瘤干细胞数量有限，普通肿瘤细胞培养花费的人力与财力颇大，长期大量培养各种肿瘤细胞会需要很多培养试剂、配置专人、容易污染致死，甚至出错；肿瘤干细胞培养存活率低；培养普通肿瘤细胞因培养瓶或培养箱 空间有限，获得的细胞数量也就不多，从中再抽取肿瘤干细胞，得到的肿瘤干细胞量就更少，远无法满足需求。因此，开发一种操作简单、快捷的有助于获取高产量的肿瘤干细胞(CSC)的制备方法也是非常有必要的。 

近年来，已经有关于肿瘤干细胞疫苗具有抗肿瘤疗效的报道，理论上灭活的肿瘤干细胞可被直接作为疫苗，但是临床上的疗效很不理想，因此有必要研究和开发适合于临床应用的肿瘤干细胞疫苗。 

原发性肝癌(primary carcinoma of liver，以下简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一。据20世纪90年代统计，我国肝癌的年死亡率为20.37/10万，在恶性肿瘤死亡顺位中占第2位，在城市中仅次于肝癌；农村中仅次于胃癌。由于血清甲胎蛋白(AFP)的临床应用和各种影像学技术的进步，特别是AFP和超声显像用于肝癌高危人群的监测，使肝癌能够在无症状和体征的亚临床期作出诊断，加之外科手术技术的成熟，以及各种局部治疗等非手术治疗方法的发展，使肝癌的预后较过去有了明显提高。传统的治疗肝癌的方法是首选手术切除，但不是所有的肝癌患者都适合手术。只有心肝功能较好，肝脏肿瘤较局限，没有转移条件的患者才适宜手术。加上我国肝癌患者多数有肝炎、肝硬化的病史，临床有80％左右的患者因各种原因不能手术。肝癌具有侵袭性和难治愈的特点,治疗后仍有可能复发或转移。而其起源、复发与转移的真正原因可能是存在于肝癌内极少数具有干细胞的自我更新能力和多向分化潜能的细胞群，即肝癌干细胞，这些细胞具有化疗、放疗及缺氧抵抗性，同时具有高致瘤性、高侵袭转移性，在肝癌的发生﹑发展乃至转移﹑复发中起着极其重要作用。然而，放疗和化疗对存在于肿瘤中数量较少的干细胞样细胞群疗效甚微，经过治疗后残存的肝癌干细胞的增殖足以促使肝癌复发和转移之一。目前尚缺乏有效的肝癌干细胞疫苗，本领域技术人员在这方面亟待取得突破。 

发明内容

本发明的第一个方面是提供一种肝癌干细胞疫苗，对肝癌患者具有积极地治疗效果，可增强患者的免疫功能。 

本发明所述的肝癌干细胞疫苗包括：按体积比为3:1:1混合的灭活的肝癌干细胞、甘露聚糖肽和脂肪乳。 

本发明的第二个方面提供一种肝癌干细胞疫苗的制备方法，可实现简单、快 捷地获取高产量、易于质量控制的肝癌干细胞，并制备出临床上有效的肝癌干细胞疫苗。 

本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：获得肝癌干细胞；将所述肝癌干细胞灭活；将灭活的肝癌干细胞冻融在生理盐水里，与佐剂甘露聚糖肽、脂肪乳混匀，从而获得所述的肝癌干细胞疫苗。 

根据本发明所述的肝癌干细胞疫苗的制备方法的进一步特征，所述灭活包括：将肝癌干细胞由-80℃至20℃反复冻融五次致死。