[发明专利]一种从植物中提取和测定血红素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种色素的提取及测定方法，主要涉及一种从植物中提取和测定血红素的方法。

背景技术

血红素是一类重要的四吡咯卟啉类化合物，广泛分布于动物的血液、肌肉以及一些植物组织中。在动物中，血红素主要存在于血液中的红细胞中，与珠蛋白结合在一起共同构成了血红蛋白；在植物中，血红素作为细胞色素酶、过氧化物酶的辅基参与了电子传递。目前，动物中的血红素提取研究较多，也较成熟，已经有了比较完整的体系，可以实现批量生产。从动物血液中提取的血红素被广泛运用于药物和保健食品，用于治疗营养性贫血、恶性肿瘤、肝炎等。在植物中，血红素的结构和叶绿素非常相似，都是由四个吡咯环化形成的卟啉化合物，血红素的卟啉环中螯合了一个铁离子，如图1所示，而叶绿素卟啉环中螯合了一个镁离子，如图2所示。在生物合成的前期阶段，从ALA合成到Proto IX合成都是血红素和叶绿素所共有的，如图3所示。血红素分子还能作为信号因子调控谷氨酸-tRNA还原酶（叶绿素合成过程中的第一个关键的限速酶，该酶可直接影响整个叶绿素合成过程）以及光合作用相关的核基因的表达。因此，准确测定植物中的血红素含量对研究叶绿素代谢调控机制非常重要。动物血液中的血红素含量很高，研究很多，提取也较简便，技术也较成熟；植物组织中的血红素含量很低，研究得较少，提取比较困难，也没有比较便宜且可信的测定方法，成为叶绿素代谢研究工作中的一个瓶颈。

发明内容

本发明的目的是针对植物中血红素提取比较困难的问题，提供一种从植物中提取和测定血红素的方法，该方法能够准确测定植物中的血红素含量，在叶绿素代谢调控机制的研究中发挥重要作用。

本发明实现上述目的采用的技术方案是：一种从植物中提取和测定血红素的方法，包括以下步骤：

步骤一、植物血红素的提取

a.准确称取待测植物的新鲜叶片1g，置于预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后转移至离心管中，加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到初级产物，备用；再向得到的初级产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ，震荡均匀后离心，弃去上清液，重复向离心产物中加入丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ、震荡和离心操作，直至得到的离心产物为无色，得到次级产物，备用；

所述混合溶液Ⅰ中丙酮所占的比例大于混合溶液Ⅱ中的比例；

b.在步骤a得到的次级产物中加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，备用；然后向离心得到的沉淀中再次加入盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液，震荡均匀后离心，收集上清液，合并两次上清液，得到混合提取液，备用；

c.向步骤b得到的混合提取液中加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，将分液漏斗多次倒置后静置分层，收集上层溶液，备用；并向下层溶液中再次加入乙醚，混合均匀后加入到分液漏斗中，静置分层后收集上层溶液，合并两次得到的上层溶液，置于分液漏斗中，然后加入与合并的上层溶液等体积的蒸馏水进行洗涤，静置分层后取乙醚层，加入到旋转蒸发仪中浓缩，再将浓缩产物倒入离心管中，用氮气吹干，即得到干燥的植物血红素，备用；

步骤二、植物血红素含量测定

向步骤一得到的干燥的植物血红素中加入7.44ml蒸馏水和0.48ml 5N NaOH，搅拌至植物血红素溶解后再加入12 ml蒸馏水和4.08 ml 吡啶，再次混合均匀，采用紫外分光光度计测定574.5nm处的吸光度，测量时在样品中加入几滴二硫酸盐和50mmol/L的铁氰化物，取独立的三株或者三株以上的植物的叶片进行测定，多次测定求平均值，得到平均吸光度A，备用；

步骤三、植物血红素浓度的计算

将步骤二得到的平均吸光度A代入线性回归方程：A=2.6814496C+0.07506221，计算得到稀释倍数C，再根据Ci = 0.5C mg/ml，计算出植物叶片中血红素的浓度Ci。

步骤a所述的震荡均匀所需的时间为10-25min，离心条件为离心力4000g、离心时间8-20min。

步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅰ中丙酮和蒸馏水的体积比99：1，混合溶液Ⅰ每次的加入量为10ml。

步骤a所述的丙酮与蒸馏水的混合溶液Ⅱ中丙酮和蒸馏水的体积比80:20，混合溶液Ⅱ每次的加入量为5ml。

步骤b所述的盐酸、丙酮与蒸馏水的混合溶液中盐酸、丙酮和蒸馏水的体积比为5：80：15，每次的加入量为5ml。