[发明专利]联用三种单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中应用

权利要求书

1.一种肿瘤细胞的分选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抗HLA-G的单克隆抗体、抗EpCAM的单克隆抗体、抗CK8/18的单克隆抗体分别偶联免疫磁珠得抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠；

(2)将抗HLA-G免疫磁珠，抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后加入到待分选的细胞液中，用免疫磁珠分离方法进行分离，其中抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠和抗CK8/18免疫磁珠混合后的质量百分比分别为55-65％、30-40％、5-15％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗EpCAM的单克隆抗体为EBA-1、A-20或C-10，所述抗CK8/18的单克隆抗体为CM-058、M20或A-9，所述抗HLA-G的单克隆抗体为MEM-G/2、MEM-G/9或4H84。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中抗HLA-G的单克隆抗体、EpCAM的单克隆抗体和抗CK8/18的单克隆抗体与免疫磁珠偶联均为抗体过饱合偶联。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗HLA-G的单克隆抗体和免疫磁珠之间用料质量比为300μg抗体:100μg活化磁珠；所述抗EpCAM的单克隆抗体与免疫磁珠偶联的用料质量比为100μg抗体:100μg活化磁珠；所述抗CK8/18的单克隆抗体和免疫磁珠偶联的用料质量比为100μg抗体:100μg活化磁珠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠的制备：取经活化的磁珠，加入饱合偶联用量的单克隆抗体和PBS，于室温下圆周混合3h，PBS清洗三次，加入甘氨酸混合，封闭剩余的醛基；加入含有BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，PBS清洗3次，加入PBS缓冲液漩涡震荡，即得到均匀的修饰有一抗的免疫磁珠。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中抗HLA-G免疫磁珠、抗EpCAM免疫磁珠、抗CK8/18免疫磁珠混合后的质量百分比分别优选60％、30％、10％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待分选的细胞液与EpCAM免疫磁珠，CK8/18免疫磁珠和HLA-G免疫磁珠混合物的用量体积比是100:(40-80)。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体方法是：取待分选的细胞液100μL，细胞数10⁷/mL，分别加入EpCAM免疫磁珠，CK8/18免疫磁珠和HLA-G免疫磁珠的混合物30-50μL，2mg/mL，28℃温箱中孵育30分钟后，在磁力架上利用免疫磁珠磁分离方法，将悬浮液弃之，用适量的0.01M PBS，pH＝7.4重复洗涤3-4次，将悬浮液弃之，最后每管用100μL PBS重悬磁珠后，使用细胞计数板对肿瘤细胞数进行计数。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞包括乳腺癌肿瘤细胞、食道癌症、非小细胞肺癌、子宫癌、结肠癌或胃癌。