[发明专利]检测肿瘤标志物电致化学发光免疫传感器的制备及应用

权利要求书

1.一种检测肿瘤标志物的电致化学发光传感器的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将导电玻璃切割成所需要的大小，并进行预处理；

（2）利用已有方法在导电玻璃方形区域内聚合上聚苯胺，并合成g-C₃N₄、银金核壳纳米球及金属氧化物；

（3）羧基化g-C₃N₄，用连接剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合液将其固定在聚苯胺上，用于固定一抗；

（4）将银金核壳纳米球修饰在金属氧化物上，然后将二抗修饰在银金核壳纳米球上；

（5）将制作好的电致化学发光传感器结合电致化学发光仪对肿瘤标志物进行检测。

2.本发明所述聚苯胺/g-C₃N₄、金属氧化物/银金核壳纳米球及传感器的制备包括以下步骤：

（1）将导电玻璃先被切成4 cm×1 cm的长条，用乙醇、丙酮和二次水依次进行15 min超声波洗涤，通过Adobe Illustrator制作用于凡士林印刷模板的模具，将凡士林涂在ITO导电玻璃上的特定区域；

（2）聚苯胺的制备：聚苯胺的制备是通过电聚合制备的，由导电玻璃作工作电极、铂电极作对电极，Ag/AgCl电极作参比电极组成的三电极体系中进行的，电解液由4.00 mL 3 M的硝酸和0.40 mL苯胺组成，在工作电极上所施加的电压以0.1 V·s^-1的扫描速度在-0.2-1.2 V之间循环，由此制得聚苯胺；

（3）g-C₃N₄的制备：称取10 g三聚氰胺于坩埚中，在550 ℃高温炉中灼烧4 h；

（4）将（3）得到的g-C₃N₄置于盛有硝酸溶液的三口瓶中，冷凝回流24 h，然后离心洗涤4次，最后溶于10 mL二次水中备用；

（5）在（2）制备的聚苯胺表面滴加连接剂溶液，然后取10 μL（4）制备的g-C₃N₄滴加到表面，用水洗掉未反应的g-C₃N₄，室温下晾干备用；

（6）银纳米球的制备：a溶液包括3mL乙二醇、90 mM硝酸银，b溶液包括3 mL乙二醇、147 mM 聚乙烯吡咯烷酮、0.22 mM氯化钠；取一个三口瓶加入5mL乙二醇，加热至153℃，然后将a、b两溶液同时逐滴缓慢的加入到三口瓶中，经过一系列的反应最后颜色变为黄色，用丙酮和水分别离心洗涤，收集沉淀；

（7）将（6）制备好的银纳米球加入到3 mL含有聚乙烯吡咯烷酮的水中，加热到100 ℃并保持10 min，然后加入100 μL 1 % 的氯金酸溶液，加热10 min至颜色稳定，然后用饱和氯化钠清洗里面的氯化银，最后用水离心洗涤聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，将得到的银金核壳纳米球分散到二次水中；

（8）本发明所涉及的金属氧化物包括氧化锌、氧化铜、二氧化锰，在不同的条件下制备得到这三种金属氧化物；

（9）将（8）得到的金属氧化物加入到（7）的悬浮液中，搅拌反应24 h，二次水离心洗涤，分散到1 mL二次水中，由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球的悬浮液；

（10）将二抗加入到（9）制备的悬浮液中反应30 min，最后用牛血清白蛋白 封闭活性位点，由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球修饰二抗的复合粒子，将制备好的溶液保存在4 ℃的冰箱中待用；

（11）在（5）制备好的电极上依次修饰上一抗、抗原、（10）得到的二抗复合粒子，在含有硝酸的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光的检测。