[发明专利]卵巢组织冻融后早期体外培养液及培养方法

权利要求书

1.一种卵巢组织冻融后早期体外培养液，其特征在于，包括：

用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；

其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：0.8-1.2份胶原酶和8.8-9.2份含有10％胎牛血清的L-15培养液；

所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为8-12％人白蛋白、体积份数为0.8-1.2％的ITS，含量为0.2-0.4IU/ml的人卵泡刺激素、45-55μg/ml的维生素C、0.4-0.5mmol/L的丙酮酸、1.5-2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70-80IU/ml的青霉素、70-80μg/ml链霉素和8-12mmol/L的亮氨酸。

2.一种根据权利要求1的培养液体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织；

将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液。

3.根据权利要求2所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述步骤将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织中，具体包括：

将冻融后的卵巢组织在无菌超净工作台上切成体积为1-1.2mm³的块状；

将块状的所述卵巢组织放入含有10％胎牛血清的L-15培养液后，在温度为35-37℃、CO₂体积含量为4-5％的培养箱中孵育8-10分钟，得到孵育后的卵巢组织小块；

将所述孵育后的卵巢组织小块加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织。

4.根据权利要求3所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述将块状的所述卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织的步骤中：

所述培养的时间为25-30分钟。

5.根据权利要求4所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液的步骤中；

所述培养皿为4孔或24孔培养皿。

6.根据权利要求5所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述步骤将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织之后，在所述步骤将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液之前，还包括：

将培养皿的内部包被有由琼脂糖或海藻酸钠珠作为细胞外基质的三维支架。

7.根据权利要求6所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液的步骤中，所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿具体包括：

在培养皿的每个孔中预先加入700-850微升第二培养液，再加入3-4块呈块状的预处理后卵巢组织。