[发明专利]一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于多位点锚定技术的细胞膜特异性荧光成像试剂，还涉及该试剂的制备方法。

背景技术

细胞膜不仅在结构上将细胞个体包裹形成稳定的内部环境，而且在功能上参与了物质运输、能量传递、信号转导、囊泡运输、细胞生长、分化、粘附、转移、应激、胞吞、胞吐、凋亡、坏死、自噬等很多重要生物学过程，因此关于细胞膜的研究越来越受到重视。采用荧光染料对细胞膜进行标记和示踪的荧光成像技术是研究细胞膜结构和功能的有力手段。

然而，目前市售的亲脂性荧光染料如DiD家族(DiO、DiI、DiA、DiR等)和FM家族(FM 4-64、FM 2-10等)存在很多的不足。如DiD家族为长链亲脂性二烷基碳菁类染料，与细胞膜接触后，这种染料会在细胞质中逐步扩散，将整个细胞染色。由于该类染料为小分子，它们很容易被内吞并使细胞内部各种细胞器的膜结构均被染色，因此失去了细胞膜成像的特异性。FM染料家族虽然通过增加极性头部的方式一定程度上提高了染料分子在细胞膜上的稳定性，但染色10min以上仍然会造成内吞。

为了解决荧光染料内吞的问题，目前也有很多科研人员开发了一些新型染料用于细胞膜成像，其中主要是通过在疏水锚定基团上增加亲水性头部的方式进行设计。如把极性头部设计成四个精氨酸多肽，通过带正电的方式增加在膜上的亲和力(ACS Appl.Mater.Interfaces 2014,6,8971–8975.)。也有报道把极性头部设计成聚甘油树状大分子，不仅提高了水溶性，防止了内吞，而且还可以耐受不同的pH环境和不同离子强度(Bioconjugate Chem.2013,24,153–158.)。尽管这些新型细胞膜特异性染料比市售的染料效果好，但都是利用一条或两条疏水尾巴作为细胞膜锚定单元，通过改善亲水性头部的方式进行设计。由于它们都是小分子荧光染料，所以很容易被细胞内吞(尤其染色时间长时，内吞更明显)，并进一步导致这种单一位点锚定的方式很难有技术突破。加之其合成复杂、成本高等因素，难以大规模应用。因此，非常有必要开发一种新型的细胞膜特异性成像试剂。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种染色时间短且不易被细胞内吞的细胞膜成像试剂。

技术方案：本发明提供的一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂，为侧链含有疏水单元和荧光单元的乙二醇壳聚糖。乙二醇壳聚糖在任何pH值的水溶液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特点。疏水单元可通过疏水相互作用多位点地插入细胞膜，并把高分子和荧光分子锚定到细胞膜上；同时，乙二醇壳聚糖把疏水单元和荧光单元以共价方式交联起来，防止其被细胞内吞；荧光分子实现荧光成像。

作为优选，所述疏水单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在5％到30％；所述荧光单元占乙二醇壳聚糖重复单元数的百分比在1％到5％。

作为另一种优选，所述乙二醇壳聚糖(glycol chitosan)的分子量在10000以上，优选10000-100000。

作为另一种优选，所述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素E；所述疏水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。

作为另一种优选，所述荧光单元包括异硫氰酸荧光素或磺基罗丹明B磺酰氯，其通过与氨基反应接枝在乙二醇壳聚糖表面。

本发明还提供了上述一种基于多位点锚定的细胞膜荧光成像试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取疏水单元分子和乙二醇壳聚糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；

产物透析、冻干；

(2)产物和荧光单元分子室温反应，产物透析、冻干，即得。

有益效果：本发明提供的细胞膜荧光成像试剂，基于多位点锚定技术，其生物相容性好、合成简单、成本低廉、染色时间短且不易被细胞内吞，可以用做细胞膜特异性示踪标记探针。

具体而言，本发明相对于现有技术，具有以下突出的优势：

(1)该试剂的组成成分如乙二醇壳聚糖、PEG等的选用都具备生物相容性，而且疏水单元分子更是动物细胞的固有成分，因此该试剂毒性低，100μg/mL以下，MTT试验显示对细胞活力几乎无影响(如图2所示)。

(2)该试剂所用的乙二醇壳聚糖水溶性好，同时PEG的引入，也进一步增加了成像试剂整体的水溶性，可以方便地直接用于细胞膜成像。