[发明专利]一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法

权利要求书

1.一种长效蛋白质药物表达复性修饰双标签质粒载体，其特征在于：所述双标签质粒载体的出发载体是IPTG诱导表达的质粒载体，所述双标签质粒载体包含有至少一个目标蛋白N端的Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ IDNo.2)和目标蛋白C端的Intein的DNA序列；优选地，所述IPTG诱导表达的质粒载体为pTWIN1质粒载体或pGEX质粒载体。

2.一种用于长效蛋白质药物表达复性修饰的蛋白，其特征在于：翻译得到所述蛋白的DNA序列中包括SEQ ID No.3。

3.一种长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

pSumo-Intein质粒载体的构建步骤：将Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)连接入已酶切掉目标蛋白的N端的Intein的DNA序列的IPTG诱导表达的质粒载体，得到pSumo-Intein质粒载体；

人源SENP2催化域蛋白的制备步骤：将SENP2催化域的DNA序列(包括SEQ ID No.3)连接入pGEX4T1质粒载体，得到SENP2-pGEX4T1质粒载体；再将所述SENP2-pGEX4T1质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、收集纯化处理，得到人源SENP2催化域蛋白；

目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建步骤：将目标DNA连接入所述pSumo-Intein质粒载体，得到pSumo-目标DNA-Intein质粒载体；

pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和复性纯化步骤：将所述pSumo-目标DNA-Intein质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、裂解和消化处理、孵育处理、复性处理、自剪切处理、酶切处理、洗脱处理，得到目标蛋白。

4.根据权利要求3所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述目标DNA为proinsulin突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.4)或GLP1类似物exendin-4突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.5)。

5.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述人源SENP2催化域蛋白的制备步骤中，

所述诱导表达处理为：挑取所述SENP2-pGEX4T1质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；

所述收集纯化处理为：先进行裂解和消化处理：将所述诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；再进行纯化处理：将所述消化液离心取上清，在该上清中加入谷胱甘肽珠，孵育后再离心，保留沉淀，再将该沉淀清洗、洗脱，得到洗脱上清液，即为所述人源SENP2催化域蛋白的溶液。

6.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和纯化复性步骤中，

所述诱导表达处理为：挑取pSumo-目标DNA-Intein质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；

所述裂解和消化处理为：将所述诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；

所述孵育处理为：将所述消化液离心后取沉淀，向该沉淀中加入尿素和二硫苏糖醇，得到孵育液；

所述复性处理为：向所述孵育液中加入IMAC树脂，再加入含有尿素的复性缓冲液，清洗后得到复性树脂复合物；

所述自剪切处理为：向所述复性树脂复合物中加入含有2-巯基乙基磺酸钠的自剪切缓冲液，清洗后得到自剪切树脂复合物；

所述酶切处理为：向所述自剪切树脂复合物中加入含有所述人源SENP2催化域蛋白SENP2的酶切缓冲液，得到酶切树脂复合物；

所述洗脱处理为：将所述酶切树脂复合物清洗后，加入洗脱缓冲液，离心后取上清，得到目标蛋白的溶液。

7.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述pSumo-Intein质粒载体的构建步骤中，所述Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.6-15。