[发明专利]一种细胞治疗用临床治疗级表皮干细胞应用人类细胞外基质筛选及规模化培养制备方法

说明书

一、技术领域：

本发明属于生物干细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附环境分离筛选，临床治疗级皮肤表皮干细胞的培养、扩增技术。获得临床治疗级皮肤干细胞应用于组织工程皮肤构建技术中的活性种子干细胞。

二、背景技术介绍：

皮肤是人体最大的器官，参与抵御生物入侵、紫外线辐射以及防止水分丢失、调节体温维持个体外貌等方面起着十分重要的生理作用，其是人体免疫系统组成的重要的一部分，而皮肤细胞是构成这器官的基本单元，皮肤细胞基础研究领域是揭示皮肤健康、发育、预防、创伤疾病治疗的重要科研途径。

细胞外基质基质(extracellular matrix，ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分，是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的及其重要场所。早期研究学者认为.外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966年研究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象。并在两年之后，得以证明学者们才对这种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。

Hay在11年后报道了ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行为的现象得以关注并进行广泛的研究但是并没有成型的理论基础佐证ECM与细胞的密切关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间“动态互惠”的模型。在这个模中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞浆中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，引起某些特定基因的表达。

并证明这些基因的表达产物又可以反过来对ECM发生作用，今天的许多研究证实了这个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用直接参与了细胞的黏附、生长、游走、分化和程序性死(凋亡)的过程；外基质参与调节细胞因子、生长因子的活性；还能够直接激活、启动细胞内信号传导机制。由于这种对细胞的调节和对信号的传导作用。因此，我们必须充分了解细胞外基质的化学的、物理的、生物学性质和功能及其在组织的形成和修复中的作用，才能更好地应用这些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完善再生的“生物构架”。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深入开展对ECM的认识，同时也反作用得到我们可利用的干细胞，这种研究模式促进学科前行及发展。

皮肤干细胞在正常皮肤组织中含量极少，干细胞公认是一种在体内具有无限更新能力，且可分化形成相应全层组织分化细胞，体外培养具有长期生长潜能并可形成无限克隆。是愈合修复创面，皮肤更新代谢再生的重要参与者。但由于目前缺乏理想筛选方法，对于细胞进行筛选及鉴定方法报道较少。

三、皮肤干细胞名称概述

1981年Potten提出，皮肤干细胞(skin stem cell)。表皮干细胞(epidermal sten cell，ESC)或角朊干细胞(Keratinocyte stem cell，KSC)；真皮干细胞(dermis stem cell)、或真皮多能干细胞(dermal multipotent sten cell)或称为皮肤前体细胞(skin-derived precursor)。

表皮干细胞具有慢周期(slow cycling)与自我更新能力两大突出特点，更新能力表现在增殖分化形成皮肤表皮全层，在体外连续传代呈现克隆性生长，表皮干细胞可连续140～160次分裂，即可产生1×10⁴⁰/个子代细胞，产生的表皮足以为此单位个体(每人)提供终身更新所需的量。

表皮干细胞存在于表皮内，可增殖分化为表皮中各种细胞的祖细胞，是由原始外胚层细胞形成。其数量较少，周围血供良好，营养丰富、所处微环境具有优异性；在损伤或生长刺激等因素下可增殖，具有慢周期性；具有未分化细胞的特征；自我更新增殖能力强；体外克隆能力突出等优势细胞特征。创伤修复的再生重建重要愈合细胞。

四、传统筛分方法介绍

因为皮肤干细胞对基底膜有较强的粘附性，对细胞胞外基质的粘附速度要比其它类型细胞快得多，所以利用该种特性进行培养筛选。目前传统的皮肤干细胞筛选如下阐述：