[发明专利]用于检测乳腺癌易感基因SNP的引物、荧光探针及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种用于检测乳腺癌易感基因SNP的引物、荧光探针及应用。

背景技术

乳腺癌是全世界女性最常见的癌症之一，在中国女性癌症中发病率更是高居首位。根据卫生部发布的数据来看，我国乳腺癌的发病率仍有上升趋势。而在美国等发达国家，乳腺癌的发病率和死亡率却在不断下降，这不仅是因为诊断和治疗水平的提高，更重要的是采取了早期筛查。乳腺癌的常见筛查包括自我检查、B超检查、X射线检查等。这些检查方法都是建立在乳腺癌已经发生的基础上，如果能在乳腺癌还没发生之前进行筛查，找出乳腺癌高危人群，可以极大程度的减少乳腺癌的发生和死亡，例如肿瘤标志物检测和乳腺癌易感基因检测。

大量科学研究表明，某些基因的基因状态与乳腺癌的发生密切相关，这些基因叫做易感基因，例如BRCA基因，该基因变异的人群患乳腺癌的概率为87％，而正常人群患乳腺癌的概率为12％。BRCA基因的变异能显著增加乳腺癌的患病概率，因此通过检测BRCA基因的基因状态能够找出乳腺癌的高危人群，然后针对性的进行预防。好莱坞明星安吉丽娜·朱莉检测到自己BRCA基因变异后，通过切除乳腺的方法将乳腺癌的患病概率由87％降到5％。

BRCA基因在白人特别是犹太人中变异较多，而在中国人群中变异非常少，不适合于在中国人群中进行乳腺癌高危人群的筛查。上海瑞金医院郑伟教授发现ESR1基因以及其他基因与中国女性乳腺癌患病概率显著相关，而且在中国人群中变异频率较高，更适合在中国人群中做乳腺癌高危人群的筛查。

检测易感基因的常见方法有限制性酶切法、多重PCR、测序、芯片检测和荧光定量PCR。目前最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，低引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。芯片检测更适合高通量基因检测，不适合几个基因的检测。而荧光定量PCR中的高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性高。荧光定量PCR中的Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。其基本原理是：应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自的基因型；用两种荧光染料FAM，HEX(VIC)分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。所以该方法中引物长度，探针长度，引物特异性，探针特异性对检测结果的特异性和敏感性非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测乳腺癌易感基因SNP的引物、荧光探针及应用。

为实现上述目的，本发明提供的第一组用于检测乳腺癌易感基因SNP的引物(以下简称第一组引物)，所述引物为如下引物对：

(1)正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)由正向引物F-01或反向引物R-01的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；

上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含rs1219648SNP位点。

本发明还提供了一组与第一组引物配合使用的荧光探针(以下简称第一组探针)，所述荧光探针包括如下两条：

1-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

1-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述1-A探针及1-G探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且1-A探针的5’端报告基团与1-G探针的5’端报告基团不同。