[发明专利]一种检测大丽轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂

说明书

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌的检测，具体涉及一种检测大丽轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂。

背景技术

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）是引起棉花黄萎病的病原菌，能够造成多种植物黄萎病的发生，在世界范围内造成重大经济损失，属于我国进境检疫性有害生物。该病菌能够以微菌核形态在土壤中存活多年，借助机械设备、水流、土壤等传播危害，化学药剂很难有效杀灭该病菌，该病菌的有效控制迄今仍然是一项世界难题。为了有效地控制这一病害，首先必须对病菌进行快速、准确的检测，这对于控制该病菌危害，及时阻断其传播、扩散，起着关键作用。迄今为止，国内外检测大丽轮枝菌种类的方法有选择性分离培养、生物学测定、血清学方法、分子杂交法、PCR法（如公开号为CN103602677的发明专利申请），但生物学很难准确快速区分，也存在鉴定周期长、时效性差等问题。而PCR方法需进行PCR后处理，易发生交叉污染，存在假阳性、假阴性或特异性不强等缺点，检测方法费时、繁琐、专业人员素养要求高，难以满足口岸快速检测通关需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测大丽轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂，该检测试剂可以快速、准确、特异检测大丽轮枝菌，避免交叉污染、假阳性、假阴性等问题。

一种检测大丽轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，引物和探针的核苷酸序列如下：

正向引物（VD3F）：5'- CGT ACG ATT GAG AAG TTT GAG ATA AGT G-3'；

反向引物（VD3R）：5'- CGT CGG AAA CCA TGA AAA CA-3'；

探针（VDMGB3）：5'- CTG CTT GAA TCT ACA C-3'，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。该检测试剂扩增的目标片段长度为100bp，其核苷酸序列为：CGTACGATTG AGAAGTTTGA GATAAGTGGA ACCCCTGCTT GAATCTACAC ATAATTCCCT TTGATTCCAA GAAAATACCA TGTTTTCATG   GTTTCCGACG。

本发明的优点在于一种检测大丽轮枝菌的实时荧光PCR检测试剂，以待检测样品DNA为模板，用检测大丽轮枝菌的引物和探针进行实时荧光PCR，检测扩增产物荧光信号，检测简单、快速、灵敏、准确、特异，与模板互补配对的荧光探针提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性，检测时荧光信号自动收集，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1、检测大丽轮枝菌的专用引物和探针的设计

从GenBank调出大丽轮枝菌及其近似种翻译延长因子的基因序列，利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出大丽轮枝菌的保守基因序列，根据引物和探针设计的一般原则，用软件Primer Express 3.0设计引物和TaqMan-MGB探针，再将设计的引物和探针在NCBI上比对，通过筛选最终确定一对引物和一条探针，其序列为：正向引物VD3F：5'- CGT ACG ATT GAG AAG TTT GAG ATA AGT G-3'；反向引物VD3R：5'- CGT CGG AAA CCA TGA AAA CA-3'；探针VDMGB3：5'- CTG CTT GAA TCT ACA C-3'，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。

实施例2、实时荧光PCR检测大丽轮枝菌的特异性试验

具体过程包括以下步骤：

一、样品来源